GBT25168-2010畜禽cDNA文库构建与保存技术规程.pdf

'ICS65．020．30B40雷目中华人民共和国国家标准GB／T25168—2010畜禽cDNA文库构建与保存技术规程TechnicalregulationoffarmanimalscDNAlibraryconstructionandpreservation2010-09-26发布2011-03-01实施宰瞀髁紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促19 刖菁本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC／TC274)归口。本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：马月辉、关伟军、陆涛峰、李向臣、佟春玲、余露露、刘鹏。GB／T25168—2010 1范围畜禽eDNA文库构建与保存技术规程本标准规定了畜禽cDNA文库构建方法。本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽cDNA文库构建与保存。2规范性引用文件GB／T25168—2010下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3．1eDNAcomplementarydeoxyribonucleicacid以成熟mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的eDNA链。3．2eDNA文库eDNAlibrary将处于特定发育阶段真核生物体的特定器官或组织中提取的总RNA，经过反转录等一系列的生化反应合成双链cDNA群体后，再插入到适当的载体上，经转化寄主菌株构成特定的eDNA克隆群体。3．3寡核苷酸oligonueleotide一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称，常用作探针确定DNA或RNA的结构。3．4噬菌斑plaque被噬菌体感染的细菌所释放的子代噬菌体，会继续感染周围的细胞，致使在琼脂平板上生长的菌苔中有大量的细胞发生裂解，形成的透明区域。4试剂及溶液配制除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB／T6682一级用水的要求。4．1焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)处理水在1000mL去离子水中加人1mLDEPC，37℃静置12h，高压灭菌(120℃30min)。4．22mol／LMgSO,称取246．50gMgS04·H20，加400mL双蒸水(doubledistilledH20，ddH20)溶解后，定容到500mL，高压灭菌。4．3TOmmol／LMgso．量取1mL2mol／LMgS04加ddH20定容到200mL，高压灭菌，30rain。4．41mol／LTris-Cl(p町．5)称取121．14gTris，碱溶于800mLddH20中，调pH至7．5，定容到1L，高压灭菌。4．5SM缓冲液称取5．80gNaCI、2．00gMgS04·7H20，量取50mL1mol／LTris—CI(pH7．5)和5mL2％(质1 GB／T25168—2010量浓度)明胶，定容到1L，高压灭菌。4．65x一链缓冲液250mmol／LTris(pH8．3)，30mmol／LMgCl2，375mmol／LKCl。4．710xDNA连接酶缓冲液500mmol／LTris—C1(pH7．8)，100mmol／LMgCl2，100mmol／L二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，0．5mg／mL牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)。4．8LB液体培养基取10．00gNaCl、10．00g细菌培养用胰蛋白胨和5．00g细菌培养用酵母提取物加1LddHzO溶解后，高压灭菌。4．9LB固体培养基取10．00gNaCl、10．00g细菌培养用胰蛋白胨、5．00g细菌培养用酵母提取物和20．00g细菌培养用琼脂加1LddHzO溶解后，高压灭菌。4．10LB顶层培养基将0．70g琼脂糖加入100mLLB液体培养基中，高压灭菌。4．1120％麦芽糖取20．00g麦芽糖溶于100mLddHz0中，过滤除菌。5主要仪器、设备水浴锅、电泳仪、电泳槽、电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、PCR扩增仪、超纯水仪、一80℃低温冰箱、凝胶自动成像分析系统和低温离心机等。6cDNA文库构建6．1样品采集畜禽机体的组织可作为构建cDNA文库的实验材料。将新鲜离体的组织样品迅速投放到液氮中，或剪切成1mm3大小的组织碎块后放人RNA保存液中。6．2总RNA提取使用TRIzol法提取畜禽组织的总RNA。在不断填充液氮的研钵中将30mg～i00mg的组织样品磨碎，加入1mLTrizol(含有酚、异硫氰酸胍、8一羟基喹啉和伊巯基乙醇的单相液)，混匀后移至经DEPC处理水浸泡过的离心管中，静置5min。加入200“L三氯甲烷，混匀，静置2min3min，4℃下，132009离心15min。移上清至另一离心管中，加入400“L异丙醇，混匀后静置10rain，4℃下，132009离心10min。弃上清，用DEPC处理水配制的75％乙醇洗涤沉淀2次，室温静置5rain10min，晾干后用50pL～100pL的DEPC处理水溶解沉淀后用1％变性琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖0．3g，DEPC处理水21．6mL，10×Mops3mL，37％甲醛5．4mL，核酸显示剂2pL～3pL)检测RNA质量，于一80℃冰箱中保存。6．3eDNA合成6．3．1eDNA第一链合成采用5’末端RNA转录子转换机制(switchingmechanismat5’endoftheRNAtranscript，SMART)技术合成全长cDNA双链。首先取一PCR管分别加入0．05pg～1．0btg总RNA样品、1．0pL10ttmol／L经过修饰的Oligo(dG)的寡核苷酸和1．0pL10mmol／L经过修饰的Oligo(dT)3。引物，添加DEPC处理水使总体积达到5．0pL，混匀，72℃下放置2min，冰浴2rain。然后，分别加入2．0pL5×一链缓冲液、1．0pL20mmol／LDTT、1．0ttLlommol／L脱氧核糖核昔三磷酸(deoxyribo—nucleosidetriphosphate，dNTP)和1．0“L200U／／』LPrimerscripTM反转录酶，混匀，42℃下放置1h，冰浴2min终止反应后进行下一步操作或--20℃下短期保存。6．3．2eDNA第二链的合成取一PCR管分别加入2．0pL一链cDNA、80pLddH20、10／zL10×Extaq缓冲液、2．0ttL GB／T25168—20102．5mmol／L50×dNTP、2．0pL10pmol／L5’引物、2．0pL10pmol／L经过修饰的Oligo(dT)3’引物和2．0pL5U／uLExtaq酶，总体积为100pL，混匀，95℃预变性25S后，95℃变性25s，68℃退火延伸6min，共21个循环。用1．1％琼脂糖对5．0“LPCR产物进行电泳检测，双链cDNA的分布范围在0．1kb～4．0kb之间。引物序列为；5’引物序列5’一AAGCAGTGGTATcAACGCAGAGTGGCCATTACGGccGGG一3’3’引物序列5’一ATTCTAGAGGccGAGGcGGccGAcATG_d(T)30N一1N-37(N—A，G，C或T；N一1一A，G或C)6．4cDNA的纯化、酶切与分离6．4．1cDNA的纯化取一PCR管分别加入50pL2．0pg～3．0pg双链eDNA、2．0PL20ug／pL蛋白酶K，混匀，45℃下放置20min。然后加入50pLddH：O和100pL苯酚一三氯甲烷一异戊醇(25：24：1)，混匀，132009离心5min。移上清至另一离心管中，加入100”L三氯甲烷一异戊醇(24；1)，混匀，132009离心5min。移上清至另一离心管中，分别加入10“L3mol／L乙酸钠(pH4．8)、1．3pL20tzg／pL肝糖元、260止95％乙醇，132009离心20min。弃上清，用100pL80％乙醇洗涤沉淀后干燥10min，然后加人79止ddH20溶解沉淀。6．4．2cDNA的酶切取一PCR管分别加入79pL双链cDNA、10pL10×靳I缓冲液、10pL20U／uLS—I内切酶和1．0pL100×BSA，总体积为100”L，混匀，50℃下放置2h。加2．0pL1％的二甲苯胺指示剂，混匀。6．4．3cDNA的分离重悬分离柱内容物，自然滴尽柱中溶剂，加入700pL柱缓冲液，滴尽。加入100PL酶切产物，滴尽。加入100pL柱缓冲液，滴尽。加人600”L柱缓冲液，用16支离心管分别逐滴收集，每管一滴。每管取3．0ⅡL样品，用1．1％琼脂糖凝胶进行片段大小检测。收集300bp以上的cDNA片段于一离心管中，分别加入1／10体积3mol／L乙酸钠(pH4．8)、1．3“L20mg／mL肝糖元和2．5体积95％乙醇，混匀，--20℃下沉淀12h。4℃下，132009离心20rain，弃上清，干燥10rain，7．0“LddH20溶解沉淀，混匀，一20℃保存。6．5cDNA片段与载体的连接取一PCR管分别加入100ng的cDNA、1．0pL500ng／／1LhTriplEx2载体、0．5pL10×DNA连接缓冲液、0．5“L10mmol／L三磷酸腺苷(adenosine—triphosphate，ATP)、0．5“L400U／uLT4DNA连接酶，加ddHzO使总体积达到5．0“L，混匀，16℃下连接12h。6．6cDNA重组体的包装解冻包装蛋白抽提物，取10pL，加入4．0pL连接产物，混匀，22℃下包装2h后加入500PLSM缓冲液和20pL三氯甲烷，混匀。进行未扩增文库滴度测定或4℃保存。7文库的扩增与保存在含10mmol／LMgS04、终浓度为0．2％麦芽糖的LB液体培养基中培养VCS257菌，使细菌ODsoo值为2．0，10009离心10min，然后用10mmol／LMgS04重悬细胞，调O矾。值至4．0。分别在20个离心管中加入500pL的菌液和足够形成6．0×104个～7．0×104个噬菌斑的稀释包装液，37℃放置15rain后加到3mLLB顶层培养基中，混匀，立即倒人LB琼脂平板中，涂匀，37℃放置6h～18h，直至噬菌斑相互接触后，每个平板上再加12mLSM缓冲液，4℃放置12h后，50r／rain，37℃振荡培养1h。最后将噬菌体溶解物移至50mL离心管中，加入10mL三氯甲烷，混匀，20009离心10rain，再将上清液转移到另一离心管，加二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)至终浓度为7％后分装，--70℃长期保存。'