NYT2058-2011 水稻二化螟抗药性监测技术规程 毛细管点滴法.pdf

'ICS65.020B15中华人民共和国农业行业标准NY/T2058—2011水稻二化螟抗药性监测技术规程毛细管点滴法Technologicalrulesformonitoringinsecticideresistanceinstripedstemborer,ChilosuppressalisWalk.,usingtopicalapplicationmethod2011-09-01发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2058—2011前言本标准按照GB／T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、南京农业大学。本标准主要起草人：邵振润、沈晋良、李永平、胡君、张帅、高聪芬、何月平、周威君、苏建亚。Ⅰ NY/T2058—2011水稻二化螟抗药性监测技术规程毛细管点滴法1范围本标准规定了毛细管点滴法监测水稻二化螟对杀虫剂抗性的基本方法。本标准适用于水稻二化螟对具触杀作用的有机氯、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、沙蚕毒素类、苯基吡唑类、昆虫生长调节剂及大环内酯类等常用杀虫剂的抗性监测。2仪器设备电子天平(感量0.1mg)；天平（感量1g）；培养皿(小培养皿：直径5cm，高1.2cm;大培养皿：直径18.5cm，高3cm)；养虫笼(长23cm×宽23cm×高32cm)；青霉素瓶(容量为5mL)；移液管或移液器；容量瓶(10mL、25mL)；玻璃广口瓶或果酱瓶(瓶底直径8cm，高10cm)；毛细管点滴器：容积通常为0.04µL～0.06µL(精确度为0.01µL)；钢精锅(中号：直径24cm，高13cm；大号：直径33cm，高18cm)；调节电炉（电压220V，功率1000W×2）；白色搪瓷盆(长30cm、宽20cm、高4.5cm)；手提式压力蒸汽灭菌器；恒温培养箱、恒温养虫室或人工气候箱。3试剂与材料3.1生物试材3.1.1试虫：水稻二化螟(ChilosuppressalisWalk.)3.1.2水稻品种：采用感虫品种汕优63或一种当地有代表性的、非抗虫杂交水稻品种。3.2试验药剂杀虫剂原药。4试验步骤4.1试材准备4.1.1试虫采集选当地具有代表性的水稻秧田或本田3块以上，采集二化螟卵块100块以上；或白天在田间用捕虫网、养虫笼等丁具捕捉成虫或夜晚在黑光灯下诱集成虫200头以上，供室内饲养。4.1.2试虫饲养4.1.2.1成虫产卵采集的成虫放入恒温培养箱中的养虫笼中，相对湿度为85%～90%，在未用药处理的感虫、生长嫩绿的秧苗上分批产卵（1d～2d一批），所产卵块分批在恒温培养箱中培育至黑头。1 NY/T2058—20114.1.2.2幼虫饲养将大田采集或室内饲养已黑头的卵块接人栽有5cm～6cm高稻苗的玻璃广口瓶或果酱瓶中（每瓶幼虫密度控制在约100头），置于温度为28℃±1℃、光周期为16h﹕8h(L﹕D)的恒温培养箱、恒温养虫室或人工气候箱中，设弱下光照，以免幼虫逃逸。饲养至生理状态一致、体重范围在每头6mg～9mg的4龄幼虫供试。4.1.3供试水稻取一定量水稻种子在适宜的温度下（一般28℃）浸种2d，催芽露白后，播人玻璃广口瓶或果酱瓶中，瓶口封上一层保鲜膜并扎少量透气孔，置于适宜的温度下培养，待稻苗长至5cm～6cm时即可供初孵幼虫饲养用。4.1.4试验人工饲料按附录A配制人工饲料，并于4℃冰箱中储存，或可现做现用。试验前从冰箱中取出，待回温至室温，即可用于毒力测定试验。每培养皿加长约2cm、厚约0.5cm的条状饲料供饲养幼虫用。4.2药液配制在电子天平上用容量瓶称取一定量的原药，用有机溶剂（如丙酮等，杀虫单、杀螟丹等用体积为l：1的丙酮：水混合液）溶解，配制成一定浓度的母液。用移液管或移液器吸取一定量的母液加入青霉素瓶，用上述溶剂配制成一定质量浓度的药液供预备试验，根据预备试验结果，再按照等比法用青霉素瓶配制5个～7个系列质量浓度，每个浓度的药液量不宜少于2mL。4.3处理方法挑取每头体重为6mg～9mg4龄幼虫置于盛有人工饲料的培养皿中，每皿5头，每浓度重复6次，共30头。供试药液浓度按从低到高的顺序处理，用容积为0.04µL～0.06µL的毛细管点滴器将药液逐头点滴于幼虫胸部背面，以点滴丙酮（或丙酮：水=1﹕1）为空白对照。处理后将培养皿转移至温度为28℃±1℃，光周期为L﹕D=16h﹕8h条件下饲养和观察。4.4结果检查分别于处理后48h（有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类、有机氯类等杀虫剂）、72h（大环内酯类和苯基吡唑类杀虫剂）、96h（沙蚕毒素类杀虫剂）、120h（昆虫生长调节剂类杀虫剂）检查试虫死亡情况，记录总虫数和死虫数。5数据统计与分析5.1死亡率计算方法根据调查数据，计算各处理的校正死亡率。按式(1)和式(2)计算，计算结果均保留到小数点后两位。KP=×100…………………………………………(1)1N式中：P1——死亡率，单位为百分率(%)；K——表示每处理浓度总死亡虫数，单位为头；N——表示每处理浓度总虫数，单位为头。PP−t0P=×100………………………………………(2)2100−P0式中：P2——校正死亡率，单位为百分率(%)；Pt——处理死亡率，单位为百分率(%)；P0——空白对照死亡率，单位为百分率(%)。2 NY/T2058—2011对照死亡率<20%应按式(2)进行校正；对照死亡率≥20%，试验需重做。5.2回归方程和半致死剂量计算方法采用SAS、EPA、Polo、BA、DPS等统计软件的机率值分析法进行统计分析，求出每个药剂的毒力回归方程式、LD50值及其95%置信限、b值及其标准误。6抗性水平的计算与评估6.1部分杀虫剂对水稻二化螟的敏感毒力基线（参见附录B）6.2抗性水平的计算根据敏感品系的LD50值和测试种群的LD50值，按式(3)计算测试种群的抗性倍数(RR)，计算结果均保留到小数点后一位。测试种群的LDRR=50………………………………………（3）敏感品系的LD506.3抗性水平的评估根据抗性倍数的计算结果，按照表1中抗性水平的分级标准，对测试种群的抗性水平作出评估。表1抗性水平的分级标准抗性水平分级抗性倍数，倍敏感RR＜3.0敏感性下降3.0≤RR＜5.0低水平抗性5.0≤RR＜10.0中等水平抗性10.0≤RR＜40.0高水平抗性40.0≤RR＜160.0极高水平抗性RR≥160.07监测报告编写根据统计结果和抗性水平评估，写出正式抗性监测报告，并列出原始数据。3 NY/T2058—2011附录A（规范性附录）水稻二化螟人工饲料配方和制备A．1人工饲料配方水稻二化螟人工饲料配方见表A.l。表A．1水稻二化螟人工饲料配方组分编号配料含量1葡萄糖5g2酪蛋门（干酪素）15g3干酵母10g4麦芽粉20g5稻茎叶粉10g6威氏盐2g7胆固醇0.2g8蔗糖5g9氯化胆碱0.5g10山梨酸1g11琼脂10g12自来水400mL131%甲醛2mL14抗坏血酸钠2gA．2人工饲料配制的操作步骤A．2.1根据饲养种群的数量，确定所需配制人工饲料的量（如用表A.1配方的5倍或10倍量等）。在天平（感量1g）上分别称取表A.1中1号～10号人工饲料组分,倒入钢精锅（中号）内,加入所需水量的1／2，搅拌均匀,盖上锅盖放入高压锅内蒸煮，喷气后15min即可拔除电源,等待自动放气或慢慢人为放气；A．2.2在天平（感量1g）上称取琼脂,放入钢精锅（大号）中,并加入另外1／2水量,在调节电炉上边煮边搅，以防焦枯；A．2.3琼脂完全煮溶化后，将上述钢精锅内蒸煮的混合物倒入琼脂锅内，充分混匀；A．2.4冷却至55℃后，加入抗坏血酸钠、甲醛，充分混匀；A．2.5稍冷却（待锅中上层开始凝固）后，倒入大培养皿或白色搪瓷盆内，冷却后加盖或封上保鲜膜。放入冰箱备用。4 NY/T2058—2011附录B（资料性附录）部分杀虫剂对水稻二化螟敏感毒力基线2000年和2002年采集于黑龙江省五常市二化螟幼虫，在室内不接触任何药剂的情况下用汕优63杂交稻及人工饲料在室内传代饲养，得到敏感品系，已建立的敏感毒力基线见表B．1。表B．1部分杀虫剂对二化螟敏感品系(Hwc-s)的毒力基线LD-P线LD50（95%置信限）药剂Y=µg／头阿维菌素16.553＋3.0725X0.00017(0.00014~0.0002)氟虫腈19.841＋4.9672X0.0010(0.0009～0.0012)辛硫磷17.338＋5.2746X0.0046(0.0039～0.0052)三唑磷11.911＋3.1340X0.0062(0.0051～0.0074)毒死蜱15.661＋5.1388X0.0084(0.0073～0.0095)杀螟硫磷14.623＋4.7241X0.0092(0.0080～0.0103)二嗪磷15.593＋7.6081X0.00405(0.0368～0.0458)敌百虫8.809＋3.3573X0.0734(0.0610～0.0891)乙酰甲胺磷6.5371＋4.0588X0.4181(0.3509～0.4985)虫酰肼7.7348＋1.5092X0.0154(0.0107～0.0208)硫丹8.7410＋5.3268X0.1985(0.1765～0.2232)杀虫单6.1721＋2.1494X0.2849(0.2293～0.3579)注：Hwc-s表示在黑龙江省五常市采集到的二化螟敏感品系。5'