GBT26938-2011 牛胚胎生产技术规程.pdf

'ICS65．020．30B43a园中华人民共和国国家标准GB／T26938--2011牛胚胎生产技术规程Standardforproductiontechnologyofbovineembryo2011-09-29发布2012-02-01实施宰瞀鹊鬻帮"1量-1：警矬赞星发布中国国家标准管理委员会仅19 刖昌(；BIT26938--2011本标准的附录A为规范性附录，附录B、附录c、附录D为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC／TC274)归口。本标准起草单位：内蒙古自治区家畜改良工作站。本标准主要起草人：高雪峰、张立、包呼格、韩锦龙、李忠书、陈巴特尔、黄春华、包和平、德庆、刘长海。 牛胚胎生产技术规程GB／T26938--2011范围本标准规定了供体牛的选择与饲养管理、超数排卵及配种、牛非手术冲胚及胚胎质量鉴定、胚胎的冷冻与保存等技术规程。本标准适用于牛体内胚胎生产技术操作。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4143牛冷冻精液GB／T5458液氮生物容器3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3．1供体牛donor可用于胚胎生产的母牛。4供体牛的选择与饲养管理4．1供体牛的选择条件4．1．1品种优良，符合品种外貌特征，生产性能好。4．1．2遗传性能稳定，谱系清楚。4．1．3年龄以14月龄至10岁为宜。4．1．4无流产史，产后空怀90d以上，有两次以上正常发情周期。4．1．5体质健壮，生殖器官和繁殖机能正常，无遗传和传染性疾病。4．2供体牛的饲养管理4．2．1保持饲养环境卫生、温湿度适宜，避免应激反应。4．2．2制定合理的日粮配方。4．2．3满足清洁卫生的饮水需要。4．2．4超排前8周加强饲养管理，并适量补充维生素A、维生素D、维生素E和微量元素。5供体牛的超数排卵及配种5．1超数排卵5．1．1供体牛的同期发情处理5．1．1．1药品所用药品见附录A。1 CB／T26938--20115．1．1．2同期发情方法5．1．1．2．1肌肉注射PG法第一次注射：在任意一天。第二次注射：在第一次注射后第11天。第二次注射后24h～96h时观察发情。5．1．1．2．2CIDR法选定任意一天放人CIDR(含孕激素阴道栓)。5．1．2超数排卵方法以母牛自然发情、PG法发情或放CIDR之日作为发情周期第0天，在9d～13d中的任意一天开始注射FSH，每天早、晚各注射1次，间隔12h连续4d，递减注射。放CIDR的供体，在第8次注射FSH之后，取出CIDR。具体方法参见附录B。5．1．3重复超数排卵重复超排间隔时间一般为45d～60d，方法同5．1．2。5．1．4供体牛发情鉴定在第8次注射FSH之后，对超数排卵供体牛，每隔6h观察一次，每次0．5h以上。以母牛稳定站立接受其他牛爬跨或直肠检查作为发情的准确时间。5．2配种5．2．1对种公牛的要求谱系清楚，检疫合格，遗传性能稳定，生产性能优良。5．2．2配种所需器材配种所需器材见附录A。5．2．3人工输精操作要求5．2．3．1母牛外阴部应经过清洗消毒。5．2．3．2输精枪应保持无菌。5．2．3．3冷冻精液质量符合GB4143的规定。5．2．4配种时间确认发情12h后，进行第一次输精，间隔12h进行第二次输精，每次输精1支～2支，共输精2次～3次。6牛非手术胚胎采集殛胚胎质量鉴定6．1非手术胚胎采集6．1．1非手术胚胎采集所需主要器材非手术胚胎采集所需主要器材见附录A。6．1．2非手术胚胎采集所需药品非手术冲胚所需药品见附录A。6．1．3改进的磷酸盐缓冲液的配制改进的磷酸盐缓冲液(PBS)配方参见附录C。6．1．4非手术胚胎采集时间供体牛超排发情后7d士0．5d采集胚胎。6．1．5非手术胚胎采集步骤6．1．5．1将供体牛稳定，用2％利多卡因在荐椎和第一尾椎结合处或第一尾椎和第二尾椎结合处进行尾椎硬膜外麻醉，利多卡因用量宜每头5mL。6．1．5．2麻醉后将牛尾固定，清除直肠宿便，阴部及外阴清洗消毒。6．1．5．3用扩宫棒扩张子宫颈，然后插入宫颈黏液器将黏液抽出，随后把带内芯的冲胚管慢慢插入子2 GB／T26938--2011官角，当冲胚管到达子宫角弯曲处，拔出内芯5cm左右，再把冲胚管往子宫角前端推进，至冲胚管到达子宫角前端1／3～1／2处。6．1．5．4冲胚管先充一定气体，待确定气囊位置后，再充气至冲胚管固定为宜。6．1．5．5抽出冲胚管内芯。6．1．5．6连接冲胚管。6．1．5．7用50mL注射器每次吸取30mL～40mL冲卵液，夹住三通导管的输出管，将PBS从输入管注入子宫角，然后夹住输入管，使回收液从输出管流到集卵杯(500mL容量)，反复冲洗，每个子宫角用400mL～500mL的PBS溶液。6．1．5．8把集卵杯内的回收液在温室(20℃～25℃)下，用集卵漏斗过滤，最后保留10mL左右液体，倒人≠100mm培养皿中，进行镜检。6．1．5．9两侧子宫角胚胎采集完成后，将气囊空气放出，冲胚管抽至子宫体，注入青霉素、链霉素等抗菌素或预防子宫炎的药物。6．1．5．10肌肉注射或官内输入前列腺素或类似物。6．2胚胎的检出与质量鉴定6．2．1检胚把盛有回收液的培养皿放在体视显微镜下，在培养皿底划线分区，逐区检查，检出胚胎放人保存液中保存。6．2．2胚胎的发育期鉴定超数排卵后的供体牛在发情后7d士o．5d时，胚胎处于以下发育期：桑椹胚(M)、致密桑椹胚(cM)、早期囊胚(EB)、囊胚(B)、扩张囊胚(EXB)。做好采胚记录。供体牛胚胎采集、保存记录表参见附录D。6．2．3胚胎质量鉴定用形态学方法进行胚胎质量鉴定，将胚胎依次分为A、B、C、D四级。A级：透明带完整无缺陷、薄厚均匀，胚龄与发育阶段相一致，卵裂球轮廓清楚，透明度适中，细胞密度大，卵裂球均匀，无游离细胞或很少，变性细胞比例少于10％。B级：透明带完整无缺陷、薄厚均匀，发育阶段基本符合胚龄，轮廓清楚，明暗度适中或稍暗或稍浅，细胞密度较小，卵裂球较均匀，有小部分游离细胞，变性细胞比例为10％～20％。C级：透明带完整或有缺陷，轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，突出细胞占一多半，细胞变性率为30％～40％。D级：透明带完整或有缺陷，胚胎发育停滞、变性、卵裂球少而散，为不可用胚胎。7胚胎的冷冻与保存7．1胚胎的冷冻7．1．1胚胎冷冻所需器材胚胎冷冻所需器材见附录A。7．1．2胚胎冷冻所需溶液胚胎冷冻所需溶液见附录A。7．1．3胚胎冷冻操作步骤7．1．3．1胚胎的洗涤A级、B级胚胎冷冻前在保存液洗涤lo次～12次。7．1．3．2胚胎的平衡将洗涤后的胚胎放入冷冻液中，室温下平衡15min～20min。3 GB／T26938--20117．1．3．3胚胎的装管将平衡后的胚胎装人0．25mL细管，装管顺序：冷冻液(约7cm)一气泡(约0．5cm)一冷冻液加胚胎(约2cm)一气泡(约0．5cm)一冷冻液(约3em)(见图1)。乙二醇冷冻液每支细管装1枚胚胎，甘油冷冻液每支细管装1枚～5枚胚胎。气泡棉毫冷冻液冷冻藏+胚胎冷冻液封I=l处细臂标记图1胚胎装管圈7．1．3．4胚胎标记在细管塞上标记胚胎信息，包括供体牛号、发育期、数量、质量以及生产日期等。如1枚l级桑椹胚表示为1M。，其中M表示发育期，M左侧数字1表示数量，右下角数字1表示质量。7,--醇冷冻的胚胎应标记直接移植“DT”符号。同时记录在附录D中。7．1．3．5胚胎冷冻程序胚胎一保存液洗涤10次～12次一10％甘油／保存液或1．5mol／L乙二醇／保存液一平衡10min～20rain装管一冷冻仪(--5．5℃～一7．0℃)平衡5min一植冰一平衡5min一以0．3"C／min～0．6℃／rain的速率下降一一32℃～一35℃一平衡10min一投人液氮。7．2胚胎的保存7．2．1存放冷冻胚胎的液氮罐符合GB／T5458规定。7．2．2将标记后的冷冻胚胎放人液氮中保存。 附录A(规范性附录)前期准备药品、器材GB／T26938--2011A．1同期发情、超数排卵药品A．1．1前列腺素(PG)或其类似物。A．1．2含有孕激素阴道栓(CIDR)。A．1．3促卵泡素(FSH)。A．1．4生理盐水。A．2超数排卵及配种所需主要器材注射器(5mL、10mL、20mL)、CIDR放置器、解冻杯、温度计、剪毛剪、牛用输精枪、输精枪塑料硬外套、输精枪塑料软外套膜、干燥箱。A．3非手术冲胚所需主要器材冲胚管(168～208)、冲胚管内芯、子宫颈扩张棒、官颈黏液吸除器、三通管、硅胶管、注射器(5mL、10mL、20mL、50mL)、集卵漏斗、≠,100mm培养皿、≠35mm培养皿、500mL量筒、高压灭菌锅、剪毛剪、镊子等。A．4非手术冲胚所需主要药品改进的磷酸盐缓冲液(PBS)、酒精、碘酊、0．1％新洁尔灭、2％利多卡因、生理盐水、青霉素、链霉素等抗菌素、预防子宫炎药物等。A．5胚胎冷冻所需主要器材体视显微镜、胚胎冷冻仪、液氮罐、0．25mL细管、细管塞、装管器、玻璃针、细菌滤器、培养皿、记号笔等。A．6胚胎冷冻所需溶液A．6．1保存液：含0．4％牛血清白蛋白的PBS液。A．6．2冷冻液：10％甘油、1．5mol／L乙二醇冷冻液(含0．1mol／L蔗糖)。 GB／T26938--2011附录B(资料性附录)FSH4d注射时间、剂量表B．1FsH4d注射时间、剂量发情周期天数第。天第9天第10天第11天第12天第13天第14天FSH且1．8mL+发AI发Z．8mLZ．3TP_L1．3130．LPG0．6mg情FSHAI晚AI2．8mL2．3mL1．8mL1．3mL注1：本表以FSH总剂量328mg为例：(2．8+2．3+1．8+1．3)x2×20=328mg。注2：FSH(每瓶400rag)用20mL生理盐水稀释。注3：第五次注射FSH时，同时肌注PG0．6mg。注4：AI表示人工授精。6 附录c(资料性附录)改进的磷酸盐缓冲液(P璐)配方表c．1改进的磷酸盐缓冲液(P璐)配方GB／T26938--201成分含量NaCl8．00g／LKCl0．20g／LNa2HPO‘(Na2HPO。·12HzO)1．50g／L(2．916g／L)CaCl2(CaCl2·2H2O)0．10g／L(0．132g／L)KH2PO‘0．20g／LMgCl2(MRCl2·6H20)0．10g／L(0．2133g／L)丙酮酸钠0．036g／L葡萄糖(葡萄糖·Hzo)I．00g／L(I．10g／L)青毒素100000U链霉素50000U注：配制说明：(1)配制PIgS溶液的所有成分应是分析纯以上的化学制剂。(z)配制PIgS溶液所用求是电阻值超过18Mn的超纯水。(3)配制成的PBS溶液需过滤灭菌、低温冷藏(4℃～5℃)。自制现用现配，(4)配制成的PBS溶液批pH为7．2～7．6，渗透压为270mOsm～290mOsm。(5)购买的成品按说明书在有效期内使用。 GB／T26938--2011液氮罐畜主品种公畜激素处理：发情日FSH品牌(厂家)预计发情日实际发情日人工授精日第一次第二次第三次技术员时间黄体卵泡回收冷冻提筒号供体注册号附录D(资料性附录)供体牛胚胎采集、保存记录表国产／进口——冲胚时间耳号精液编号冷冻日期LH批号孕酮处理移植——桑椹囊胚退化未受精卵小筒编号细管编号胚胎数量胚胎质量解冻El期备注冷冻液：10％甘油1．5mol／L乙二醇冷冻液(直接移植DT)'