第六章 微生物与酶制剂

第六章微生物与酶制剂 一、酶制剂概述酶制剂是所有活的有机体所产生的由氨基酸组成的蛋白质，它可以控制许多反应过程和组织、动物、人类以及微生物的生物活动，它是新陈代谢中必不可少的要素。酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质，主要作用是催化食品加工过程中各种化学反应，改进食品加工方法。我国已批准的有木瓜蛋白酶、α—淀粉酶制剂、精制果胶酶、β—葡萄糖酶等6种。酶制剂来源于生物，一般地说较为安全，可按生产需要适量使用。 1.我国酶工业发展阶段1965无锡酶制剂厂BF-7658淀粉酶，首先用在淀粉加工和纺织退浆上，这是我国首次应用。1979利用黑曲UV-11糖化酶菌种进行糖化酶生产，首先在白酒、酒精行业推广应用，提高了出酒率。1990年，2709碱性蛋白酶在洗涤剂行业上应用，当时由于这种颗粒酶的出现，使加酶洗衣粉开始风行全国。1992年，1.398中性蛋白酶，166中性蛋白酶在毛皮制革行业上推广应用，提高了产品质量和效率，减轻了劳动强度。1995年，无锡酶制剂厂首先引进了耐高温α-淀粉酶和高转化率液体糖化酶，在国家科委成果办公室的推动下，将完成的"新双酶法在淀粉质原料深加工工业中应用"科研项目在酒精、味精、制糖、啤酒等行业进行了推广，从此"双酶法"技术在全国迅速得以发展。二、酶制剂工业的发展 1998年，国外酶制剂大公司纷纷到中国建厂和合资，引进了国外先进设备、优良菌种、新型酶制剂，给中国酶制剂带来了机遇和挑战。1998年，美国最大的酶制剂公司--杰能科国际公司和中国最大的酶制剂公司无锡酶制剂厂合资，成立"无锡杰能科生物工程有限公司"，将杰能科国际公司的新型复合酶源引进中国。2005年，杰能科正式成为丹尼斯克的全资子公司，继续拓展酶制剂的全球市场。2006年，酶制剂进入了全新的发展阶段，向"高档次、高活性、高质量、高水平"方向发展，向专用酶制剂和特种复合酶制剂发展，向新的应用领域发展，向新型糖类、面粉加工、肉类、油脂、调味品、饲料、纺织、纸浆、环保等方面发展。 2.国内酶制剂销售额比例 3.国际市场酶制剂销售额比例2001年工业酶制剂的世界市场约为15亿美元用于制药工业与精细化学工业约1.2亿~1.5亿美元 4．国内外酶制剂生产应用差异1．规模：国外多公司重组国内重复建设、效益低2投入：国外：开发经费高达15%，甚至19%销售额国内：研究、开发投入不足，占1%销售额3开发重点国外：大力研制、开发新酶种和新用途国内：品种少、剂型少 5．我国酶制剂工业的若干对策1．走集约化、规模化经营2．加大科研投入3．发展具有自己知识产权的新技术4．调整产品结构、大力开发新品种 三、种类及其应用一．α-淀粉酶1.耐高温α-淀粉酶2.高效耐高温α-淀粉酶3.洗涤剂α-淀粉酶4.中温α-淀粉酶二．糖化酶1．葡萄糖糖化酶2．高效糖化酶3．强效糖化酶4．新型液体糖化酶 其他品种三．ß-淀粉酶四．葡聚糖酶五．转苷酶六．果胶酶七．蛋白酶八．木聚糖酶九．脂肪酶十．纤维素酶 用途作用酶的名称酶的来源食品加工业1生产麦芽糖2果汁提取3生产高甜天冬精4生产果聚糖5果实防霉1β-淀粉酶2纤维素酶3某种热稳定酶4未定5几丁质酶1细菌2曲霉3嗜热脂肪芽孢杆菌4环状芽孢杆菌5木霉环境保护1降解纤维素2分解地下水污染物-三氯乙烯3纸浆漂白及废糖蜜水处理4原油脱硫，降低空气污染1木糖酶2三氯乙烯3木质素过氧化氢酶4未定1某种真菌2大肠杆菌工程菌3白腐菌4红球菌生物化工1生产丙烯酰胺2在特殊条件下将煤转变为液体燃料1腈水合酶2氢氧化酶1绿真假单胞菌2肠道变形杆菌医疗卫生1用于诊断心脏病和肝病2用于分析血清中的尿酸浓度3用于测定血清中的胆红素水平1胞内L-苹果酸酶2尿酸酶3胆红素氧化酶1嗜热芽孢杆菌2苛求芽孢杆菌3疣孢漆斑菌纺织业使用羊毛表面手感硬的蛋白质分解，使羊毛表面变的柔软有光泽中性耐热蛋白酶工程酵母 开发的一般程序样品采集菌种分离初筛复筛摇瓶实验最佳产酶条件组合研究微生物育种物理诱变化学诱变分子改造遗传工程基因工程酶制备收集发酵液收集菌体胞外酶破碎胞内酶酶学研究产品扩大 果蔬加工四、酶制剂在食品工业中的应用技术食品工业是用酶大户，目前已在烘焙、果蔬加工、奶制品、肉类加工和蛋白质水解等行业广泛应用。目前酶制剂品种还远远不能满足食品工业需要，酶制剂工业正不断推出新型酶制剂、复合酶制剂、高活力和高纯度特殊酶制剂来满足日益发展的食品工业需要。 奶制品工业酶在乳制品中最主要的应用，是蛋白酶的应用，特别是用凝乳酶加工奶酪和用乳糖酶将乳糖分解以提高有乳糖不耐受症的人对乳制品的消化力。 五、酶制剂在饲料工业中应用酶作为饲料添加剂的研究及应用发展很快，范围也越来越广。酶制剂由单一型转向复合型，多种酶搭配使用，起到互补作用，效果更加显著。进一步开发活性强、价位低的专用酶制剂是发展的一个趋势。酶制剂具有作用效果显著、效益高、安全无毒，能够最大限度地提高饲料的利用率和消化率，增加某些有限制用量的饲料原料的使用，进一步扩大非常规饲料资源的开发，促进动物的生长，减少动物体内氮、磷及矿物质的排泄量，减轻对环境的污染。在可持续发展的农业中，最有效地使用非常规饲料和当地的饲料资源具有重大意义。 六．酶制剂在造纸生产中的应用1．在造纸行业上生物技术的应用流程2．酶法用于纤维改造 直接利用微生物酶——（1）不稳定。在高温、高压、强酸、强碱下。（2）易失活。即使在最适合的条件下反应。（3）回收困难。用适当方法提取目的产物后，残存酶回收困难。（4）反应速度减慢。随着反应时间的推移。（5）经济上不合算。一次性反应后不能再次使用。阻碍了微生物酶的应用和发展。研制固定化酶和固定化菌体七．固定化酶技术 1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。 什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术 固定化酶固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 固定化酶的优缺点多次使用可以装塔连续反应优点：纯化简单提高产物质量应用范围广缺点：首次投入成本高大分子底物较困难 影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2．载体的影响（1）分配效应（2）空间障碍效应（3）扩散限制效应3.固定化方法的影响 固定化后酶性质的变化1．固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降2．固定化对酶稳定性的影响（1）操作稳定性提高（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。(3)对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。(4)对分解酶的稳定性提高。（5）对变性剂的耐受力升高 固定化后酶稳定性提高的原因：a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.酶活力的释放是缓慢的。c.抑制自降解，提高了酶稳定性。 pH的变化PH对酶活性的影响：（1）改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 固定化酶pH的变化1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。载体带正电荷，pH向酸性方向移动。（2）产物性质对pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。 固定化酶制备的一般方法及特点关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。1．四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法） 各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶 四种固定化酶制备方法的特点小结物理吸附包埋法共价结合法共价交联法制备易易难难结合力弱强强强酶活力高高中中底物专一性无变化无变化有变化有变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中高中制法特性 1.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固3.载体的机械强度4.固定化酶要有最小的空间位阻5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化酶要廉价固定化方法与载体的选择 固定化细胞固定化细胞是指直接将细胞固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。固定化细胞的优点：1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体。2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用。3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应。 固定化酶(细胞）应用实例固定化酶和固定化细胞应用生产时间氨基酰基转移酶DL-氨基酸的旋光度解析1969葡萄糖异构酶将葡萄糖异构变为果糖1973青霉素酰胺酶生产6-APA1973天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸1973延胡索酸酶生产L-苹果酸1974ß-半乳糖苷酶水解乳糖1977L-天冬氨酸ß-脱羧酶生产L-丙氨酸1982 固定化酶酶反应器应用分批搅拌反应器。连续流搅拌桶反应器。连续搅拌桶-超滤反应器填充床反应器循环反应器流化床反应器工农业生产上的应用医药治疗上的应用分析化学中应用亲和色谱环境保护新能源开发中基础理论研究青霉素酰化酶制造人工肾酶电极 酶反应器。分批搅拌反应器。搅拌罐型连续流搅拌桶反应器。固定床型（填充床反应器）流化床反应器连续搅拌桶-超滤反应器循环反应器膜式反应器鼓泡塔型 连续流搅拌桶反应器连续搅拌釜式反应器 填充床反应器旋转填充床 循环反应器高效内循环生物反应器（HCR） 连续搅拌桶-超滤反应器 固定化酶（细胞）的应用1．固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用2．固定化酶在医药治疗上的应用3．固定化酶在分析化学中应用4．固定化酶和亲和色谱5．固定化酶与环境保护6．新能源开发中的应用7．固定化酶在基础理论研究中应用 1．固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。葡萄糖异构酶葡萄糖果糖果葡糖浆 固定化酶在工业生产中的应用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类 固定化酶在工农业生产上的应用产物酶或细胞固定化方法原料L-氨基酸果糖浆6APAL-门冬氨酸L-苹果酸低乳糖牛奶乳糖干蛋白果汁脱苦啤酒植物白脱脂肪酸氨基酰化酶葡萄糖异构酶或含该酶之菌体青霉素酰胺酶含有门冬氨酸的菌体含有反丁烯二酸酶的菌体乳糖酶碱性蛋白酶葡萄糖氧化酶和氧化氢酶柚苷酶木瓜蛋白酶脂肪酶脂肪酶载体结合法载体结合法或交联法载体结合法胶格包埋法胶格包埋法载体结合法载体结合法胶格包埋法载体结合法载体结合法或包埋法胶格包埋法载体结合法乙酰-DL-氨基酸葡萄糖青霉素G反丁烯二酸反丁烯二酸牛奶牛奶蛋白桔类果汁生啤酒植物油植物油 产物酶或细胞固定化方法原料类固醇L-丙氨酸D-苯甘氨酸ATP核苷酸类味精乙醇啤酒L-亮氨酸乙酸乳酸淀粉酶杆菌肽氢气含脱氢酶及羟化酶的菌体含有L-门冬氨酸、β-脱羧酶的菌体氨基酰化酶乙酰激酶5’-磷酸二酯酶，5’-腺苷酸脱氨酶Sacharomycescarlsbergensie或S.Cerevisiae同上SerratiamarcescensAectobcter.sp.乳酸杆菌与酵母BacillussubstilisBacillsp.ClostridiumbutyicumRhodospirilliumrubrum胶格包埋法包埋法载体结合法载体结合法载体结合法角叉胶或聚丙烯酰胺胶包埋聚乙烯氯或多孔砖吸附或海藻酸包埋角叉胶包埋水合氧化钛吸附明胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺或琼脂包埋类固醇前体L-门冬氨酸乙酰-DL-苯基苷氨酸ADPRNA葡萄糖培养基苏氨酸培养基乙醇培养基 固定化原生质体的应用研究中：固定后化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞中的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36%，可连续使用37天。 2．固定化酶在医药治疗上的应用例1固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸酸或7-氨基头孢霉烷酸也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应合成新的具有不同恻链基团的青霉素或头孢霉素 青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素7-ACAasnucleus 青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素7-ACCAor7-ADCAasnucleus 固定化酶在医药治疗上的应用例2：制造人工肾利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化脲酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶囊尿酶可分解尿素为NH3和CO2，NH3被树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代谢废物。 固定化酶在医药治疗上的应用溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度 1、转入体内发挥作用（口服和注入）口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。注入：是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方式。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋于半透膜中，可容许小分子底物自由出入包埋膜，而药物酶和破坏它的蛋白水解酶以及其他免疫因子等不会直接接触，因而可延长酶在体内的半寿期和避免免疫过敏反应。如果选择载体适宜，或者在载体上偶联适当成分，还可使药物酶比较集中的送到靶细胞。 2、通过“体外循环”做成人工脏器固定化酶也可做成“人工脏器”参与体外循环，应用有两方面：用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢产物除去氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死”；治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的“人工脏器”加以处理，然后再回流体内。 酶应用方式载体应用对象半寿期优缺点尿酸酶门冬酰胺酶脲酶脂肪酶酪氨酸酶谷氨酰胺酶β-葡糖苷酸酶β-葡糖苷酸酶胆红素葡糖醛酸基转移酶过氧化氢酶组成体外循环移接体内循环口服体内循环体内循环体内循环体内循环体内循环体内循环血液透析装置Dacron脉管修复用和移接管尼龙微囊肠衣包被可溶性的聚顺丁烯二酸与聚丙烯酸聚合物可溶性的聚乙二醇血影细胞脂质体和聚乙烯吡咯烷酮结合的微粒体尼龙微囊急淋白血病尿胰机能不全癌瘤癌瘤取代和补偿先天缺失补偿先天缺失黄疸约2d1d1d24h24h18h短暂优点：加速尿酸移去缺点：需移去尿素优点：无免疫原性质优点：易缺点：消亡快；载体有毒优点：抗酸优点：最适pH向中性偏优点：无抗原性半寿期长优点：抗原性优点：载体能被代谢缺点：对载体内含物敏感优点：不需分离酶缺点：需辅助因子扩散优点：能做成糊状缺点：在唾液很快移除 包埋药用酶的载体可溶性载体聚乙烯吡咯酮烷多糖或糖肽聚乙二醇聚氨基酸以及血清白蛋白其他（核酸和脂类物质等）不可溶性载体半透性聚合酶脂质体红血球血影细胞 3．固定化酶在分析化学中应用酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。 固定化酶在分析化学中的应用固定化酶在生化分析和临床检验中的应用也是一个十分重要的领域，它的发展非常迅速，这不仅因为它们比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化等，而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，因此可用于较复杂体系的检测。分析化验中应用的固定化酶大体分为两类：酶传感器(酶电极)固定化酶柱检测器,包括固定化酶柱和检测器 酶电极 酶电极特点：快速、方便、灵敏、精确范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。 固定化青霉素酶层热敏电阻pH电极敏感部固定化青霉素酶层 生物传感器的基本原理；易测量的物理,化学量生物活性物质不易测量的化学,生物量基础传感器测量信号 酶生物传感器微生物细胞生物传感器动物组织生物传感器植物组织生物传感器免疫生物传感器基因生物传感器其他杂合膜生物传感器 电化学生物传感器（又称为生物电极）光学（纤维）生物传感器热敏生物传感器压电晶体生物传感器等等 生物电极还可分为；基于O2检测的生物电极基于H2O2检测的生物电极基于NH3检测的生物电极基于CO2检测的生物电极基于pH检测的生物电极电子转移介体生物电极直接电位免疫生物电极酶标免疫电极等等 研究新方向-微生物传感器呼吸活性测定型：利用固定在高分子膜上的微生物细胞的呼吸作用，测定氧气的消耗和二氧化碳的生成，从而确定被测定物质的量电极活性测定型的微生物传感器是利用固定在膜上的微生物细胞的新陈代谢作用，测定电极活性物质的量的变化。由固定化微生物膜与生物燃料电池、离子选择电极和气体电极等组成 4．固定化酶和亲和色谱亲和技术的基础：是生物活性化合物生物特异信息的综合。利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一性，可逆结合而设计的纯化方法是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方法 5．固定化酶与环境保护一：环境监测二：污染物处理。 固定化生长菌体在三废处理上的应用应用内容菌体固定化方法毒物废水处理脱氮作用CandidatropicalisPsendomonasPutida各种微生物混合培养PseadomonasspMicrococcusderitrificans聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋皂土和Mg＋＋或聚氨基甲酸乙酯海绵活性炭吸附液膜酚苯废水亚硝酸、硝酸 6．新能源开发中的应用H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好。将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气 7．固定化酶在基础理论研究中应用阐明酶反应机理揭示酶原激活机理 酶亚基性质的研究 研究蛋白质-核酸分子结构例：用N,N-亚苯基双马来酰胺交联的肌球蛋白，手臂长度推算出活性中心两个必需巯基间的距离是1.2-1.4nm 研究蛋白质-核酸分子结构连续的固定化酶柱进行DNA序列分析原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列——该系统由连续的6个固定化酶柱组成焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷酸化酶，荧光酶柱 固定化酶与基础理论1、用固定化酶研究亚基间关系：在适宜的条件下将寡聚体酶的一个亚基和载体偶联固定变性并除去其他亚基复性及活性检测亚基重组和酶性质的测定 2、应用固定化双酶或多酶系统进行模拟试验能获得一些有意义的结果将己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶固定化在一起，结果观察到偶联反应的初速度显著升高，而中间产物积累达到恒态水平所需的潜伏期大大缩短甚至消失。将上述两种酶和ATP再生系统同固定于白蛋白上，然后用能透过葡萄糖、但不能透过葡萄糖-6-磷酸的膜进行包埋，结果，在体外实现了“反抗”浓度梯度的葡萄糖的“活性运转”。3、通过固定化技术来改变酶的特性是酶分子修饰模拟的一个方面内容。