高级分子生物学sc..

NO抑制拟南芥开花转变过程的研究茹欢委2090802100作者首先在实验中观察到了用硝酸钠提供外源性的NO可以促进植物的生长,但抑制植物生殖发育.用不同浓度的硝酸钠处理拟南芥幼苗,每天光12小时,暗12小时,5周后观察拟南芥的生长状况,实验发现与对照组的幼苗相比:在苗重,莲座叶数目,抽苔等方面在硝酸钠处理100ul以下时呈现剂量依赖性的增多,并且在叶绿素含量上得到了同样的结论,提示外源性的NO抑制了拟南芥的开花过程。为了研究内源性的功能,构建培养了一种NO高表达突变的拟南芥植株nox1,并经实验加以验证。通过特异性染料染色分析证实过表达的NO在叶和根呈现高表达状态,并抑制根的生长,如何进一步确认是NO在其中起了直接的作用,作者通过图位克隆技术找到了一个与nox1形态型很接近或者说相同的基因cue1(叶绿体a/b结合蛋白低表达1的突变体)。它可以使植株尺寸减小并且网状格局绿叶变苍白,它编码一种叶绿体磷酸/磷酸转运子,多项试验证据表明cue1就是nox1。在所有实验组6种nox1突变株中,cue1都是缺失的。而NO的合成是通过NOS酶将精氨酸催化为瓜氨酸的过程中产生,在cue1突变株中这两种氨基酸的数量是对照组的很多倍,可能因为原料的倍增使内源性的NO增多。 多次试验检测也证实了NO,精氨酸和瓜氨酸明显增多的确发生在nox1和cue1-5植株组分中。说明在拟南芥中NOS介导的NO产生确实发生。接下来,作者观察到了土培的nox1以及cue1-5植株的确发生了开花晚的表型,通过不同实验组对比花环叶片数统计分析得出结论,延迟开花的表型不是光依赖的,但其表现型严重受到光照的影响。那么下调nox1是否能促进植物的开花呢?作者使用了一种Atnos1的突变体nos1,经检测其抑制NO效果明显,通过对比叶数目可以得出NO与产叶数目存在正相关,并在开花转变过程中存在重要关系。那么NO是如何调控开花过程的呢？作者在各个实验组分中分析了花分生组织认同基因LEAFY(LFY)的表达情况,LFY在成花起始中呈高表达且对成花有决定作用,并在自主调控开花机制中有重要作用,实验发现硝普钠处理后LFY基因表达被抑制,且呈剂量依赖型降低。提示了在NO抑制成花作用中,可能是,至少一部分是通过抑制LFY基因表达这条通路作用的。在4条影响成花的通路中,LFY基因都参与其中,在nox1和野生型对照中,GA可以促进成花,但不适用于nox1突变形成的矮植株,所以提示GA与NO的平行作用,并无影响。在开花影响因素中,开花抑制因子FLC也有重要作用,在延迟开花的植株中它呈高表达。同样用不同浓度硝普钠处理后,作者发现在浓度小于50ul 时,FLC表达随浓度升高呈下降趋势,但浓度高于50ul时,FLC表达又与浓度呈正相关,并且在硝普钠高浓度处理和nox1突变植株中检测到了FLC基因表达的上调,所以在低浓度硝普钠处理时并不通过此条通路。通过对nox1,野生型,nos1表现型分析,得出NO调控开花在自主途径中影响到了FLC基因。之前结果都说明了NO对植物的作用是光依赖型的,作者也观察到在cue突变后植株在光感和光形态发生上都产生了缺陷,自然就引申到是否NO也参与了光周期的调节呢?拟南芥长日照促进开花，CONSTANS(CO)是光周期通路中最常见的一个下游组分，它调节昼夜周期始终，能够促进开花。同样的，CO与硝酸钠也存在计量依赖性的表达，在nox1中低表达，nos1中高表达，提示了NO可以负调控CO表达从而影响增幅和/或时相转变。进一步的实验说明，CO的mRNA表达也与蛋白水平趋势一致，与野生型对比，在nox1中低表达，nos1中高表达。为了验证这种调节是否是直接的，作者检测了CO的上游蛋白GImRNA的表达,与COmRNA的结果一致，说明NO也扮演了CO的一个上游蛋白，通过对elf3突变和35S::CO植株的分析，可以肯定地说NO在光周期调控中存在重要作用。CO和CAB都在植物昼夜周期调节时钟的不同阶段存在不同的表达，可以作为衡量昼夜节律的输出现象 。将光照时间由每天12小时变为持续光照3天条件下，在nox1和cue1中CAB、CO以及GI的mRNA大量减少，然而生理阶段没有改变，另外一个衡量就是子叶叶运动，结果类似，也有不同程度的降低，且生理周期没有改变。为了分析NO是否作用于昼夜节律钟本身，作者检测了生物钟中央振荡器的组分TOC1和CCA1的表达，TOC1和CCA1无论在振幅还是生理期上都没有明显改变。所以似乎NO影响了昼夜节律的输出而不是改变中心振荡器。同时，检测不同时间内源性NO的存在，也能发现NO在植物昼夜节律中也呈周期性改变。作者虽然没能证实NO的产生是否与昼夜存在相关，但是就在nox1植株中影响NO体内的平衡可以导致花型改变。作者通过药理学，生理学，生化，遗传等方面的实验证明了NO抑制光周期和自主开花途径，NO可以经体外或者体内因素的调节，最终调节体内NO的平衡从而影响控制花转变的信号转导通路，这为研究开花提供了一条新的途径。NO、CCA1和TOC的水平波动可能为衡量昼夜开关提供了一个新的机制，并且NO在光感的上游起作用，调节中央振荡器的输出，最后控制花的转变。作者同时也指出NO影响很多基因的表达包括CAB、CO、GI等，它本身收到光的调节，它调节花的转变发生在光调节之后。