纳米材料在骨牙再生修复中的生物学过程研究

项目名称：纳米材料在骨、牙再生修复中的生物学过程研究首席科学家：林野北京大学起止年限：2012.1至2016.8依托部门：教育部 一、关键科学问题及研究内容（一）关键科学问题对植入式生物材料纳米结构与机体反应的调控机理与作用机制进行深入研究和认识，将有助于解决纳米生物医用材料发展面临的重大科学问题,发展具有我国自主知识产权的纳米生物医用材料，提高硬组织重大疾病诊疗水平奠定基础，满足我国社会经济和人民健康事业发展的重大需求。围绕上述国家重大需求，针对硬组织再生修复需要解决的重大科学问题，本项目拟设立4个课题，课题之间形成有机联系，通过联动与协作，重点解决以下共性关键科学问题：(1)具有高生物相容性纳米材料及其界面的设计与制备原理；(2)材料表面纳米结构与细胞、组织之间的相互作用机理；(3)纳米结构对材料/组织界面生物力学匹配性、植入体长期力学稳定性、植入体寿命的影响机制；(4)纳米生物医用材料、材料/组织界面表征新手段、新方法（二）结合科学问题的内涵将开展的主要研究内容钛合金种植体材料表面纳米拓扑结构的结构梯度和成分梯度都会影响种植体材料与细胞的相互作用，因此本研究将定量研究不同表面纳米功能梯度的新型钛合金种植体材料对骨整合相关蛋白质组变化，对成骨细胞增殖分化、破骨细胞前体转化以及成纤维细胞信号通路系列基因表达的影响，探索材料表面纳米功能梯度结构设计对骨整合界面结合特性、细胞选择过程及相关信号因子的影响规律，探讨材料表面拓扑结构对成骨的控制作用，为表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料的设计、制备和调控提供科学理论依据。利用高分子（如聚酰胺PA）优异的生物相容性及与颌骨松质骨极其接近的弹性模量以及其吸湿后微小的体积膨胀等特点，设计功能梯度涂层来调整PA涂层与钛基体间热膨胀系数，采用塑料火焰喷塑技术在蚀刻处理后的纯钛种植体表面形成一层类牙周膜功能的成分过渡的TiO2/TiO2-PA/PA高分子涂层，探讨其应力缓冲和传导特性，揭示其在结构和功能方面与天然牙周膜间的关联及相似性， 探索其模仿天然牙周膜行使功能的基础及其与周围组织间生物力学相容的机制，并利用蛋白质组学技术，从蛋白质分子水平，研究材料及表面仿生设计。牙齿硬组织仿生再生修复过程中再生层与牙体组织界面结合强度直接影响修复的长期效果与稳定。本项目将从纳米尺度/蛋白质组水平探索纳米材料在牙齿硬组织生物矿化过程中分子作用机制，合理设计和制造更加适合口腔环境临床操作的牙釉质、牙本质原位再生修复的纳米材料配方，建立基于纳米材料的牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论，实现材料与牙齿硬组织中胶原蛋白和无机盐形成多位点化学结合，解决界面结合的力学匹配性，赋予再生修复层长期力学稳定性，延长再生修复层的寿命。通过对纳米结构微环境特征对成骨相关细胞（主要是BMSCs）功能和分化调控的分子机制进行深入研究，建立材料特性与BMSCs定向分化之间的关联，将利于获得对颌骨组织再生重建机制的定量认识。本研究针对口腔颌骨修复要求，拟开展微环境特征——基因表达变化规律——与成骨分化相关指标相互关系的研究，以检测BMSCs成骨分化过程全基因组差异表达为基础，分析成骨分化信号通路，研究BMSCs在各种微环境下的成骨诱导分化，探索纳米结构特征对BMSCs成骨分化调控的机制，将更好地促进颌骨缺损组织修复并完成其功能重建，并配合牙种植体修复实现第三代口腔功能修复材料从学术研究到临床治疗应用的转变。 二、预期目标（一）总体目标本项目重点探讨仿生自组装及植入式口腔生物材料表面纳米结构对宿主反应的调控机理，阐明纳米材料与口腔牙、骨硬组织之间相互作用的生物学过程，为实现颌骨和牙齿再生修复过程中材料/组织界面的快速生物愈合和长期生物力学相容提供新的思路和理论依据。阐明钛种植体表面纳米拓扑结构对细胞生长和相关信号通路的调控机制，实现种植体-骨组织界面有效结合的再生设计，促进种植体界面的快速骨整合；揭示钛种植体表面低弹性模量纳米复合涂层模仿天然牙周膜行使功能的基础，实现种植体的长期稳定性；明确类牙釉质、类牙本质再生层与牙体组织的界面结合机制及相关物理、化学、力学及生物性能；建立基于纳米材料的牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论；阐明纳米尺度材料微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，在细胞/修复材料复合物植入体介导的颌骨组织再生机制理论认识方面取得突破。通过项目研究和国际合作与交流，产生重要创新性理论和实用成果，培养一批青年学科骨干人才，并吸引留学博士、博士后回国工作。（二）五年预期目标(1)构建功能梯度的新型钛合金种植体，系统研究材料表面纳米化技术序列处理所形成的纳米梯度结构，及该梯度结构与组织有效结合机制和技术，从纳米尺度/蛋白质组/基因水平，探索种植体表面拓扑结构对细胞生长和相关信号通路的控制机制，获得具有多孔梯度结构新型钛合金牙种植体材料成分设计和纳米结构控制方法。(2)构建钛种植体表面获得与牙周骨组织匹配的低弹性模量功能梯度高分子涂层，探讨其应力缓冲和传导特性，揭示其在结构和功能方面与天然牙周膜间的关联及相似性，探索其模仿天然牙周膜行使功能的基础及其与周围组织间生物力学相容的机制。获得具有适宜弹性模量的牙种植体成分设计和纳米结构控制方法。(3) 实现基于纳米材料自组装技术的牙釉质、牙本质原位再生；阐明类牙釉质结构、类牙本质结构的生长和组装机制，揭示基于生物矿化原理纳米羟磷灰石晶体可控有序生长、自组装的规律；合理设计和制造更加适合口腔环境临床操作的牙釉质、牙本质原位再生修复的纳米材料配方，提出并验证牙釉质、牙本质原位再生修复的临床可行应用方案。(4)通过仿生技术、纳米技术、多相复合、多级结构构建、表面功能化和微图案化等多项技术复合，获得具有仿生纳米结构的新型功能化颌骨修复材料；建立颌骨修复材料制备工艺参数——纳米结构——细胞行为的定量关联，揭示具有仿生结构支架材料与成骨相关细胞相互作用实质；阐明纳米结构微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，在细胞/修复材料以及颌骨修复材料与牙种植体复合植入过程中颌骨组织再生重建机制方面取得突破；(5)通过本项目研究，将开发出3-4种新型口腔纳米生物医用材料；在国内外申请发明专利15-20项；发表SCI论文30-50篇，培养博士、硕士研究生50人以上；承办或主持召开国际学术会议2-3次；通过与国外研究机构开展合作与人员交流，培养青年学科骨干人才16人以上。 三、研究方案（一）总体研究思路开发功能梯度的新型钛合金材料，其弹性模量与不同部位的种植体-组织界面生物力学相适宜，系统研究材料表面纳米化技术序列处理所形成的纳米多孔梯度结构，及该梯度结构与组织有效结合技术，通过细胞和动物实验探索种植体表面纳米形貌与组织界面结合特性、对细胞选择过程及相关信号因子的影响规律，探索出种植体表面拓扑结构对细胞生长和相关信号通路的控制机制，实现种植体-骨组织界面有效结合的再生设计，获得牙种植体表面纳米化设计和纳米结构控制方法。制备纯钛种植体表面TiO2/TiO2-PA/PA功能梯度涂层，考察喷塑工艺条件、原料组分比例、涂层厚度等对涂层形貌、弹性模量及附着强度的影响。并通过化学沉积法在表面定向生长HA晶体，提高PA涂层表面生物活性，考察沉积液浓度、沉积时间、沉积温度、溶液pH值等因素对HA晶体形貌、生成量、晶体生长方向、结晶度以及在PA涂层中沉积深度的影响，探讨HA晶体生长机制。并通过掺杂锶、镁、锌等微量元素替代HA中部分钙离子，以提高PA涂层的表面生物活性，加速种植体与颌骨间的骨整合。通过体外细胞与动物体内实验，对表面有纳米功能梯度涂层的种植体生物学行为进行系列研究，观察种植材料对成骨细胞、骨髓基质干细胞增殖分化能力的影响，并用定量组织学、生物力学与Micro-CT等分析手段研究种植体植入正常与骨质疏松动物模型后的骨整合能力与机械稳定性。运用量化计算和分子设计的方法，通过模拟牙釉质、牙本质生物矿化机制，研究纳米羟磷灰石晶体成核、生长及自组装的规律。探讨釉原蛋白、釉蛋白、釉丛蛋白等对牙釉质矿化的影响；探讨牙本质涎蛋白、牙本质磷蛋白等非胶原蛋白对牙本质矿化的影响；考察多肽及非多肽分子对纳米羟磷灰石晶体生长及自组装的控制；阐明牙釉质和牙本质的生物矿化机制；重点分析类牙釉质、类牙本质再生层与牙体组织的界面结合机制及相关物理、化学、力学及生物性能；合理设计和制造更加适合口腔环境临床操作的牙釉质、牙本质原位再生修复的纳米材料配方，提出并验证牙釉质、牙本质原位再生修复的临床可行应用方案，优化并建立基于纳米材料的牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论。 以脂肪族聚酯和聚酰胺为主要合成高分子，以胶原和明胶为主要天然高分子，以纳米HA等为主要无机成分，以静电纺丝为主要纳米纤维成型技术，结合表面改性、多相成分复合、多级结构建构、生长因子控释技术的研究和复合，获得在多个纳米结构特征（如本体和表面化学组成、形貌、拓扑学结构）存在显著差异的系列仿生纳米结构人工细胞外基质。应用基因工程（基因芯片和iRNA）技术，结合分子生物学手段，基于对整合素受体基因表达以及Wnt/β-catenin、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和TGF-β/BMPs等成骨分化信号通路的研究结果，阐明微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，对比研究体内外诱导和促进骨组织再生及整体血管化情况，评价颌骨修复和功能重建的效果，认识细胞/修复材料复合物植入体介导的骨组织再生机制。（二）技术路线与可行性1.牙科种植体表面纳米化促进骨整合的机理研究技术路线：(1)研究表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料制备技术：1)新型钛合金种植体基材制备：选用高强度低模量多功能钛合金，通过合金熔炼、高温锻造、中温精锻和中温轧制工艺制备牙种植体所需的棒材，研究中温变形的组织演化过程及其对生物力学性能的影响，优化材料的性能，为后续表面纳米化处理提供高韧性棒材。2)新型钛合金纳米结构表面构建：综合运用塑性变形法、化学处理、水热处理、微弧氧化等方法构建新型钛合金纳米结构表面，表征不同工艺条件下获得的纳米材料的显微组织结构特征包括表面成分及形貌、物相结构、元素化学态等以及物理化学性能。揭示表面纳米化处理工艺对钛合金表面组织结构、物理化学性能、磷灰石诱导性能等的影响规律，阐明在不同处理方式下，钛合金表面纳米化的过程及其机制，优选合适的表面纳米化处理工艺。(2)研究表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体-骨组织界面结合机制:1)表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料对破骨细胞（osteoclastcell,OC）、成骨细胞（osteoblastcell,OB）生物学行为，以及对破骨细胞-成骨细胞间信号转导影响的研究： 应用实时定量RT-PCR、基因芯片等分子生物学技术对与OC、OB细胞分化密切相关的基因、骨形成、骨吸收功能相关基因、及OC-OB信号转导因子的表达进行检测，评价不同表面纳米功能梯度的牙种植体材料在OC、OB分化、成熟各阶段的影响。从整合素信号传导通路水平阐明不同表面纳米功能梯度牙种植体材料对OC、OB细胞生物行为的影响，探索不同表面纳米功能梯度牙种植体材料对OC-OB间信号转导的影响。2)表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料对骨髓间充质干细胞（BMSCs）生物学行为影响的研究：BMSCs的分离培养、鉴定，在表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料表面生长形态的观察，以及在细胞黏附行为及细胞增殖情况的检测，然后以成骨分化信号通路、破骨细胞前体转化信号传导通路，以及成纤维细胞信号通路为研究对象，利用基因芯片、siRNA等基因工程技术检测骨整合过程中全基因组差异表达，结合形态学观察，成骨、破骨、成纤维相关指标检测，定量研究不同功能梯度的新型钛合金材料对BMSCs的粘附、增殖和成骨、破骨、以及成纤维向分化的影响。(3)研究功能梯度的新型钛合金材料的体内生物学行为：构建比格犬颌骨缺牙模型，将优选的不同多孔梯度结构种植体植入犬缺失牙部位，通过骨组织形态学计量学分析、植体-骨整合情况观察、生物力学测试、骨动力学参数分析、骨整合相关细胞信号通路基因表达分析，在不同时间点观察牙种植体骨结合情况，从不同角度观察分析评价不同的种植体表面功能梯度结构的再生设计对骨整合的影响，进一步阐明功能梯度的新型钛合金材料调控骨整合相关细胞生物学行为的分子机制。可行性分析：根据文献报道，通过应用纳米技术实现种植体表面改性对促进骨整合及维持种植体骨组织界面长期稳定具有肯定作用。本项目是在参考大量相关文献，对国内外研究状况进行全面分析以及在本课题组前期工作的基础上提出的，具有相应理论基础并可行。 在新型钛合金种植体基材制备方面，Ti2448合金是中科院金属所研制的一种高强度多功能钛合金，具有特殊的非线性弹性变形行为和高度局域化的塑性变形行为，在高强度条件下实现了金属材料的超低弹性模量、超弹性、高阻尼和低泊松比等功能性性能的统一，可为开展新型钛合金种植体提供良好的基础材料。在金属材料表面通过塑性变形法、水热法、微弧氧化、化学处理-微弧氧化复合技术等序列处理方法，构建纳米化表面等方面具有非常好的基础，目前已经获得阶段性成果。这些结果支持当前的研究思路与技术路线。在材料生物学性能研究方面，本课题组所在科室十年来在口腔种植学专业领域所作的研究及工作已得到国内外同行的认可，曾获得多项国家科研项目支持进行了相关研究，取得了具有重要意义的成果，具有完成本课题的工作基础，在实验基础上可行。在人才队伍方面，承担本项目研究工作的中坚力量和学术骨干都是我国口腔医学及生物材料学领域的学术带头人和我们团队的技术骨干，多年来从事口腔种植学工作，十年来已完成了8千余例各种条件下的牙种植修复，十年存活率达96.7%，达到国际口腔种植存活率标准，具有完成该项研究的技术能力、设备条件、病人来源及实验技术。2.牙科种植体表面低模量纳米材料涂层基础研究技术路线: 设计和优化，解决类牙釉质、类牙本质再生层与牙体组织的制备纯钛种植体表面TiO2/TiO2-PA/PA功能梯度涂层，考察喷塑工艺条件、原料组分比例、涂层厚度等对涂层形貌、弹性模量及附着强度的影响。并通过化学沉积法在表面定向生长HA晶体，提高PA涂层表面生物活性，考察沉积液浓度、沉积时间、沉积温度、溶液pH值等因素对HA晶体形貌、生成量、晶体生长方向、结晶度以及在PA涂层中沉积深度的影响，探讨HA晶体生长机制。并通过掺杂锶、镁、锌等微量元素替代HA中部分钙离子，以提高PA涂层的表面生物活性，加速种植体与颌骨间的骨整合。通过体外细胞与动物体内实验，对表面有纳米功能梯度涂层的种植体生物学行为进行系列研究，观察种植材料对成骨细胞、骨髓基质干细胞增殖分化能力的影响，并用定量组织学、生物力学与Micro-CT等分析手段研究种植体植入正常与骨质疏松动物模型后的骨整合能力与机械稳定性。(1)钛基体表面粗糙化处理：拟采用酸蚀加碱热处理的方式对钛基体表面进行粗糙化处理：采用一定浓度的HCl和H2SO4混合液先对钛基体进行浸泡酸蚀，然后将样品置于浓NaOH溶液碱化处理一定时间后，于600℃ 处理一段时间，随炉冷却。SEM观察样品表面形貌，用SEM附带的EDX能谱仪分析表面元素成分，用XRD分析表面物相成分，用表面轮廓仪表征试样表面粗糙度。(2)钛基体表面TiO2/TiO2-PA/PA梯度涂层的制备及表征：采用纳米TiO2/PA共混粉料及纯PA粉料为喷塑原料，采用火焰喷塑技术将其依次喷涂于经表面粗化处理的纯钛基体表面。调整粉料中TiO2/PA比例，越接近基体表面TiO2含量越高，随着涂层厚度逐渐增加，TiO2含量相应减少，直至最表层为纯PA粉料，最终在钛基体表面形成TiO2/TiO2-PA/PA功能梯度涂层。观察涂层表面及断面形貌，测试涂层力学强度及界面结合强度，分析Ti元素在断面上的分布情况。(3)PA梯度涂层表面生物活化处理：将涂覆PA涂层的试样浸入含Ca2+的溶剂中，在其表面溶蚀出一含Ca2+多孔层，然后将其浸泡于含PO43-溶液中，调整pH值及温度，通过化学沉积法在表面定向生长HA晶体。观察溶剂溶蚀后涂层表面及断面形貌，分析试样溶蚀不同时间后Ca2+在涂层中的分布情况；观察溶蚀处理后的涂层在不同pH值及温度的PO43-溶液中浸泡不同时间后沉积层生长情况及沉积层形貌，分析沉积层中元素分布，确定沉积层物相及结晶情况，观察晶体形貌尺寸，并确定晶体类型及晶体生长方向，探讨晶体生长机制。(4)表面HA晶体层的掺杂改性：为进一步提高PA高分子涂层表面的生物活性，促进其与周围颌骨间的骨整合，在用化学沉积法定向生长HA晶体的过程中，添加适量锶、镁、锌等元素以替代HA晶格中部分钙离子，制备微量元素掺杂改性HA晶体层，通过体外生物学评价及动物体内植入实验研究掺杂改性后的HA晶体层相对于未掺杂HA其生物活性的改善情况及促进骨整合的特性。(5)体外生物学评价及动物体内实验：通过体外细胞与动物体内实验，对表面有纳米功能梯度涂层的种植体生物学行为进行系列研究，观察种植材料对成骨细胞、骨髓基质干细胞增殖分化能力的影响，并用定量组织学、生物力学与Micro-CT等分析手段研究种植体植入正常与骨质疏松动物模型后的骨整合能力与机械稳定性。可行性分析：(1)对于“如何在钛种植体表面形成一层界面结合牢固的类牙周膜结构PA高分子涂层”这一关键问题，拟通过钛基体表面蚀刻粗化处理，在表面形成TiO2 层，以增加PA涂层与基底间的化学键合点与机械嵌合点，提高涂层附着力。在我们前期的研究中，曾对钛金属表面做过防腐处理，对钛金属的特性有较深入的了解。目前对钛金属表面蚀刻粗化处理的方法较多，而且较易操作实行。在本项目中我们将以在钛基体表面生成锐钛矿TiO2层为目标，对不同的蚀刻方法进行对比研究，从而优化出最佳蚀刻粗化方案。因此，解决此关键问题在技术上是可行的。(2)对于“如何消除或降低PA涂层与钛基体间的热膨胀系数差异，以尽可能消除涂层内部残余热应力，提高涂层结合强度”这一关键问题，拟通过设计功能梯度涂层来调整层间热膨胀系数。对火焰喷塑技术而言，通过调整电压，提高原料喷射速度，使塑化状态的原料能够渗入基体一定深度，提高涂层结合力是完全可行的。另外，改变喷塑原料的组分比例并不会对喷塑技术提出更高更苛刻的要求，因此在经过蚀刻的钛基体上喷涂功能梯度涂层在技术上不是难题。(3)对于“如何提高PA涂层表面生物活性，加速种植体与颌骨间骨整合，促进种植体早期固定”这一问题，首先，PA吸湿后有约3vol%的膨胀率，植入颌骨并吸水膨胀后可缩小甚至消除界面缝隙，对种植体的即刻稳定非常有利；同时，根据PA特殊的链结构，对其表面处理在其上生长一层羟基磷灰石，提高表面生物活性，促使其与周围颌骨组织快速形成骨整合，利于种植体早期稳固固定。前期，我们已通过溶液沉积法在PA上生长出磷灰石晶体。因此，在技术上解决此问题也是可行的。3．牙齿硬组织纳米材料自组装再生修复的机理研究:技术路线:(1)牙釉质、牙本质蛋白质介导生物矿化机制的研究：1)纳米羟磷灰石晶体的生长与自组装：纳米羟磷灰石晶体主要通过化学沉淀法制备，首先分别配置含有钙离子、磷酸根、氟离子溶液，在含有与牙釉质、牙本质矿化相关的蛋白质如釉原蛋白、釉蛋白、釉丛蛋白、I型胶原及牙本质涎蛋白、牙本质磷蛋白等非胶原蛋白存在下，通过控制各反应物的浓度、反应时间、添加顺序以及反应介质等条件控制晶体的生长和自组装的性质；分别用透射电镜、扫描电镜、扫描探针显微镜、红外、X射线粉末衍射以及激光粒度分析仪等对合成的各种形状纳米羟磷灰石晶体进行表征和分析，揭示纳米羟磷灰石晶体成核、生长及自组装的规律。2) 分子设计：运用量子化学和分子动力学方法计算模拟设计基于釉原蛋白、釉蛋白、釉丛蛋白、牙本质涎蛋白、牙本质磷蛋白等与牙釉质、牙本质矿化相关的蛋白质的多肽片段或非多肽分子，并用多肽合成仪等合成这些模型分子，考察这些分子对纳米羟磷灰石晶体的生长与自组装性质的影响，理论和实验相结合探寻设计安全、高效、经济、适合口腔生理条件下的控制纳米羟磷灰石晶体的快速生长并能自组装形成牙釉质、牙本质类似结构的分子。3)牙釉质、牙本质的生物矿化机制:综合上述的研究结果总结提出牙釉质、牙本质蛋白质介导生物矿化的新模型。(2)牙釉质、牙本质原位再生修复的研究：1)牙釉质、牙本质在模拟生理条件下原位再生修复:采用离体牙为主要实验材料，在模拟口腔生理条件下，综合上述牙釉质、牙本质生物矿化的研究结果重点考察新设计的多肽及非多肽分子对牙釉质、牙本质再生修复的作用机制；2)牙釉质、牙本质再生修复层性能评价：分别用透射电镜、扫描电镜、扫描探针显微镜、红外、X射线粉末衍射等对牙釉质、牙本质再生修复层进行表征和分析，评价牙釉质、牙本质再生修复层的物理化学性能。运用纳米力学测试系统TriboIndenter对样品表面微区进行压痕（施加正向垂直载荷力）、划痕（施加侧向载荷力）评价牙釉质、牙本质再生修复层的硬度、抗磨损性等力学性能；运用超声、万能力学试验机评价牙釉质、牙本质再生修复层与牙釉质、牙本质的结合强度。运用细胞实验评价牙釉质、牙本质再生修复层的生物安全性。3)建立并优化牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论：综合上述的研究结果总结提出牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论。(3)牙釉质、牙本质原位再生修复的临床操作方案：1)牙釉质、牙本质原位再生修复的临床应用方式：设计临床可用的器械和装置重点考察上述配方不同临床应用方式如溶液、糊剂、贴膜等与牙釉质、牙本质的作用机制，使用SEM、TEM、XRD、AFM从分子与纳米尺度对再生修复层进行研究，探索有利于临床应用的工艺路线。2)动物实验：动物实验将主要选择大动物如猪，观察并评价体内环境下上述配方及临床应用方式对牙釉质、牙本质原位再生修复的效果。 3)建立并优化牙釉质、牙本质原位再生修复的临床可行应用方案:综合上述研究结果提出牙釉质、牙本质原位再生修复的临床可行的应用方案。可行性分析：根据文献报道，通过模仿牙釉质矿化的机制，运用牙釉质矿化相关的蛋白质及类似物可以在生理条件下控制纳米羟磷灰石晶体的生长与自组装，实现类牙釉质结构的合成和制备。本项目将从仿牙釉质生物矿化机制出发实现牙釉质的原位再生修复。本课题组已在牙釉质微结构仿生合成上进行过多年的研究，发表了系列高水平的论文，引起了国内外同行的关注。前期工作受到了国家科技部973计划和国家自然科学基金的联合资助，证明在生理条件下可以运用小分子实现牙釉质的化学再生。本课题组也是国际上较早开展利用蛋白质或者小分子介导人工模拟生物矿化过程实现牙本质再矿化修复方面的研究，前期的工作已经证明仿牙本质磷蛋白序列的含14个氨基酸残基的多肽片段可以有效诱导羟基磷灰石晶体的形成。我们与美国Gower和Boyan小组合作发现可以采用高分子诱导羟基磷灰石在胶原蛋白上形成珍珠状有序排列的仿骨结构。鉴于牙本质与骨组织的类似性，这也间接地证明了牙本质可控再矿化的可行性。虽然牙本质和牙釉质的结构和形成机制有很大差异，但两者都是在蛋白质介导下的生物矿化，将两者放在一起研究探讨，可以互相借鉴，起到事半功倍的效果。 业领域所作的研究及工作已得到国内外同行的认可，曾获得多项国家借本项目是在参考大量相关文献，对国内外研究状况进行全面分析以及在本课题组前期工作的基础上提出的；另外，课题组主要成员为青年教师和研究生，既有材料、化学、医学也有生物学研究的背景，学术思想活跃，科研投入时间充足，并且具有良好的团队合作精神。依托单位在生物材料合成和制备、细胞生物学、分子生物学及口腔医学等方面的仪器设施先进齐全，可为课题的实施提供保障，因此，实现本项目的预期研究目标有保证。4.颌骨缺损修复材料纳米化构建与再生重建机制研究技术路线：(1)仿生纳米结构人工细胞外基质的制备1) 纳米纤维支架的设计与制备：以水或具有不同挥发性和电导率的有机液体为溶剂，将天然、合成高分子和/或表面接枝改性后的无机纳米粒按不同比例混合，静电纺丝制备单组分或多组分复合纳米纤维。利用溶剂挥发性和电导率的差异获得具有不同表面拓扑结构的纳米纤维；改变溶液浓度、流速、接收距离、电压等参数调控纤维直径；改变接收装置，制备具有不同三维拓扑结构的纳米纤维支架，并通过牵伸调控纤维排列间距和支架孔隙大小；多组分复合纤维的微相分离结构、表面特性、力学性能和亲/疏水性能等由上述工艺参数综合调控；2)纳米纤维的表面修饰：采用物理吸附、化学交联法或低温等离子体表面处理，将适量生物活性物质固定于纳米纤维表面；结合表面处理，采用SBF进行纳米纤维的表面矿化改性；研究纤维组成对表面改性效果的影响，及表面改性所引起的纤维形貌、表面组成、表面亲疏水性和表面矿化层的变化等；3)梯度功能化骨修复材料的设计与制备：采用不同特性纳米纤维膜铺层、模拟体液梯度生物矿化、纳米纤维网络与传统支架成型方法结合等多种手段，进行梯度功能化骨修复材料的设计与制备；4)生长因子控制释放体系制备：采用乳液法或静电喷射法，制备载目标生长因子（如骨形态发生蛋白）微纳米球，考察其理化性能和生长因子包封情况，研究生长因子微纳米球及其负载于支架材料上后的体外模拟缓释行为；(2)成骨相关细胞在不同仿生纳米结构人工细胞外基质微环境下的体外生物学研究1)BMSCs细胞黏附、增殖、分化程度的检测：细胞-材料复合物在有、无成骨诱导剂条件下培养一定时间后，采用黏着斑蛋白抗体结合方法、共聚焦显微镜观察黏着斑形成；采用抗体免疫荧光检测、显微镜观察细胞骨架蛋白的表达变化；检测细胞与基底的切向粘附力；分析细胞增殖规律。检测成骨特异性指标以及矿化结节形成能力；利用荧光定量PCR技术定量分析碱性磷酸酶及成骨分化不同阶段转录因子的表达变化规律；2)成骨分化全基因组表达变化分析：提取不同培养阶段细胞的总RNA，反转录合成cDNA，利用大鼠全基因组表达芯片检测细胞在纳米纤维支架上黏附及分化阶段的各个结构基因的转录水平变化，并结合RT-qPCR对结果进行验证；3)BMSC成骨分化信号通路研究：自行设计特异性的成骨分化信号通路（TGF-β/BMPs、Wnt和MAPK等）传导因子（BMPs、β-catenin、ERK等）的RNA干扰序列，分别转染细胞后与纳米纤维支架复合培养，探索BMSCs成骨分化信号通路的调控机理。(3)成骨相关细胞/修复材料复合物植入颌骨内的生物学特性研究 1)颌骨缺损模型的建立：以比格犬或新西兰大白兔为实验动物，无菌条件下建立直径约10mm下颌骨缺损模型；2)形态学观察：将细胞/材料复合物植入上述颌骨缺损模型中，肉眼观察比较各组植入物之间随时间的形状变化、感染、血管化、新生骨量及新生骨与正常骨的连接情况；3)X光和CT检查：利用X-ray和micro-CT技术检测各实验组在不同阶段的骨再生情况，比较各组之间的成骨量及骨修复效率；4)组织学观察：HE染色观察各实验组在不同阶段的材料降解吸收和炎性细胞浸润情况，及新生骨结构及与其周围正常组织之间的关系。可行性分析：已有研究表明，纳米纤维支架表现出良好的促进成骨相关细胞粘附、增殖和分化的特性，在特定条件下可促进间充质干细胞向特定的终末细胞分化。间充质干细胞可感应人工细胞外基质的多种物理特性，引起一系列结构基因和转录因子的差异表达，导致终末分化的不同。本课题应用成熟的静电纺丝技术，结合表面改性、多相成分复合、多级结构建构、生长因子控释等技术，获得在多个纳米结构特征（如本体和表面化学组成、形貌、拓扑学结构）存在显著差异的系列仿生纳米纤维人工细胞外基质，用于细胞分化调控研究，理论上可行。课题组在静电纺丝技术制备纳米纤维方面已做了大量工作，已研制出本课题研究所需的各种组成及拓扑学结构的纳米纤维。在表面改性、多相成分复合、多级结构建构、生长因子控释等技术方面也有很好的研究基础。这些前期研究为本课题获得在多个纳米结构特征（如本体和表面化学组成、形貌、拓扑学结构）存在显著差异的系列仿生纳米纤维骨修复支架提供了保障。不同组成、结构及表面性质的人工细胞外基质直接影响细胞的黏着程度及黏着斑的形成，在分子水平则主要表现为整合素受体基因的表达种类及程度各异；而多潜能BMSCs向成骨细胞分化的过程已被证实与Wnt/β-catenin、MAPK和TGF-β/BMPs等多个信号通路相关。因此，以整合素受体基因表达作为黏着斑形成指标，以Wnt/β-catenin、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和TGF-β /BMPs等成骨分化信号通路为研究对象，利用基因芯片、siRNA等基因工程技术检测成骨分化过程中全基因组差异表达，结合形态学（黏着斑）观察和成骨相关指标（ALP、BMP-2、CTSK和Runx-2）检测，定量研究不同纳米结构特征微环境对成骨相关细胞生物学行为的影响，阐明仿生纳米结构人工细胞外基质微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，理论上可行。本课题组已经熟练掌握基因芯片、siRNA等技术，为上述工作开展奠定了基础。（三）创新点(1)构建功能梯度的新型钛合金种植体，系统研究材料表面纳米化技术序列处理所形成的纳米梯度结构，及该梯度结构与组织有效结合技术，从纳米尺度/蛋白质组/基因水平，探索种植体表面拓扑结构对细胞生长和相关信号通路的控制机制，获得具有多孔梯度结构新型钛合金牙种植体材料成分设计和纳米结构控制方法,是研究思路与研究方法的创新。(2)构建钛种植体表面获得与牙周骨组织匹配的低弹性模量功能梯度高分子复合涂层，探讨其应力缓冲和传导特性，揭示其在结构和功能方面与天然牙周膜间的关联及相似性，探索其模仿天然牙周膜行使功能的基础及其与周围组织间生物力学相容的机制，并利用蛋白质组学技术，从蛋白质分子水平，研究材料及表面仿生设计，是研究思路上的创新。(3)运用量化计算和分子设计的方法，通过模拟生物矿化，探寻新的多肽及非多肽小分子，控制纳米羟磷灰石晶体的生长与自组装，实现生理条件牙釉质、牙本质原位再矿化，这是一条新的研究和临床修复思路。牙釉质、牙本质原位再矿化临床方案的实现将对口腔保健及再生医学治疗龋病具有重要的科学和实践意义。(4)以Wnt/β-catenin、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和TGF-β/BMPs等成骨分化信号通路为研究对象，定量研究不同纳米结构特征微环境对成骨相关细胞的黏附、自我更新和成骨向分化的影响，阐明仿生纳米结构人工细胞外基质微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，是研究思路上的创新。(5)将基因芯片、iRNA技术等新近兴起的前沿生物学技术应用于上述研究，检测成骨分化过程中全基因组差异表达，结合形态学（黏着斑）观察和成骨相关指标（ALP、BMP-2、CTSK和Runx-2）检测，准确地检测和分析仿生纳米结构人工细胞外基质微环境特征对BMSCs成骨分化的调控机制，是研究方法上的创新。 (四)课题设置及相互关系根据项目及各课题实施的需要，本项目拟申请国家纳米研究重大科学研究计划专项研究经费3000万元人民币，课题设置和经费比例如下。课题名称承担单位负责人主要学术骨干经费比例钛种植体表面纳米化促进骨整合的机理研究北京大学林野周玉、魏大庆、李述军、卫彦28.33%牙种植体表面低模量纳米材料涂层基础研究四川大学胡静张利、关少轩、李继华、邹琴26.67%牙齿硬组织纳米材料自组装再生修复的机理研究北京大学陈海峰胡秀莲、华红、韩冰、李刚28.33%颌骨缺损修复材料纳米化构建与再生重建机制研究中国人民解放军总医院王征蔡晴、焦斌、邓旭亮、胡晓阳16.67%1、课题设置课题一、牙科种植体表面纳米化促进骨整合的机理研究课题负责人：林野主要技术骨干：周玉、魏大庆、李述军、卫彦承担单位：北京大学，哈尔滨工业大学，中国科学院金属研究所经费比例：28.33%主要研究内容：(1)研究新型钛合金牙种植体表面纳米梯度功能化制备技术：选用高强度低模量多功能钛合金，通过合金熔炼、高温锻造、中温精锻和中温轧制工艺制备牙种植体所需的高韧性棒材。通过表面机械研磨处理技术、化学处理、水热处理、微弧氧化及后续纳米结构调控等序列处理方法，形成纳米多孔梯度分布的材料表面，考察表面纳米化序列处理技术对表面功能梯度结构、表面形貌、晶体结构、化学组成、表面润湿性、蛋白吸附、离子释放等性能的影响，获得具有多孔梯度结构新型钛合金牙种植体材料成分设计和纳米结构控制方法。(2)研究表面纳米功能梯度新型钛合金牙种植体-骨组织界面的结合机制: 利用蛋白质组学技术、基因芯片、siRNA等工程技术，在纳米尺度/蛋白质分子/基因水平，定量研究不同表面纳米功能梯度的新型钛合金牙种植体材料对骨整合相关ECM（细胞外基质）-整合素-CSK（细胞骨架）蛋白质组变化，成骨/破骨细胞信号转导、成骨分化、破骨细胞前体转化以及成纤维细胞信号通路系列基因表达的影响，探索材料表面纳米功能梯度结构设计对骨整合界面结合特性、细胞选择过程及相关信号因子的影响规律，探讨无机相拓扑形貌对成骨的控制作用，设计一种新型钛合金种植体材料。(3)研究表面纳米功能梯度新型钛合金牙种植体的体内生物学行为：构建比格犬颌骨缺牙模型，将优选的不同多孔梯度结构种植体植入犬缺失牙部位，通过扭力测试、FSEM和EDX观察分析种植体-骨组织界面情况，通过形态学观察、活体荧光标记新骨形成、X光、CT检查和骨组织形态计量学的测量，以及植入部位β-catenin、MAPK和TGF-β/BMPs、RANKL、OPG、PI3K/Akt等蛋白表达分析等手段，从不同角度观察分析评价不同的种植体表面功能梯度结构的再生设计对骨整合的影响，进一步阐明功能梯度的新型钛合金材料调控骨整合相关细胞生物学行为的分子机制。预期目标：(1)选用高强度低模量多功能钛合金，通过合金熔炼、高温锻造、中温精锻和中温轧制工艺制备牙种植体所需高韧性棒材。(2)获得具有表面纳米功能梯度牙种植体的成分设计和纳米结构控制方法，实现种植体-骨组织界面有效结合。(3)探索出种植体表面纳米拓扑结构对骨整合相关细胞生长和相关信号通路的控制机制。(4)发表SCI收录学术论文10篇以上，申请专利2-3项，培养学科交叉型博士、硕士、博士后人才10-15名。课题二、牙科种植体表面低模量纳米材料涂层基础研究课题负责人：胡静主要技术骨干：张利、关少轩、李继华、邹琴承担单位：四川大学，中国科学院金属研究所经费比例：26.67% 主要研究内容：(1)钛基体表面粗糙化处理：研究钛基体表面的酸碱粗化热处理技术，在表面形成一层TiO2粗糙层，利用塑料火焰喷塑技术，在处理后的钛基体表面涂覆一层类牙周膜结构聚酰胺（PA）高分子涂层，考察其结合强度及力学性能。(2)钛基体表面TiO2/TiO2-PA/PA梯度涂层的制备及表征：研究PA涂层与钛基体间的热膨胀系数差异，通过引入组分梯度过渡的功能梯度TiO2/TiO2-PA/PA涂层，以尽可能消除涂层内部残余热应力，提高涂层结合强度。(3)PA梯度涂层表面生物活化处理：通过用含钙离子溶液对PA涂层表面进行溶蚀处理，在其上形成一定厚度的含钙离子多孔层，并将其浸入含磷酸根溶液中，通过调节pH值、沉积时间及沉积温度等条件，采用化学共沉淀法在PA涂层表面原位定向沉积生长羟基磷灰石晶体，以提高PA表面生物活性。（4）表面HA晶体层的掺杂改性：为进一步提高PA高分子涂层表面的生物活性，促进其与周围颌骨间的骨整合，在用化学沉积法定向生长HA晶体的过程中，添加适量锶、镁、锌等元素以替代HA晶格中部分钙离子，制备微量元素掺杂改性HA晶体层，通过体外生物学评价及动物体内植入实验研究掺杂改性后的HA晶体层促进骨整合的特性。（5）体外生物学评价及动物体内实验：通过体外细胞与动物体内实验，对表面有纳米功能梯度涂层的种植体生物学行为进行系列研究，观察种植材料对成骨细胞、骨髓基质干细胞增殖分化能力的影响，并用定量组织学、生物力学与Micro-CT等分析手段研究种植体植入正常与骨质疏松动物模型后的骨整合能力与机械稳定性。预期目标：(1)探索出钛基体表面最佳粗化处理工艺及表面锐钛矿型TiO2层的形成机制，确立喷塑原料组分的梯度变化与涂层结合强度及弹性模量间的对应关系，明确梯度涂层中纳米TiO2粒子含量的梯度变化对涂层结合强度的影响。(2) 揭示PA高分子涂层表面羟基磷灰石晶体可控定向生长的机制，明确其与牙槽骨间发生骨整合的内在机理。(3)阐明具有功能梯度PA高分子涂层的钛种植体传导和缓冲应力的效果及特性，揭示所制备低模量功能梯度PA高分子涂层在结构和功能方面与天然牙周膜间的关联及相似性。(4)探明具有类牙周膜结构钛种植体植入不同时间后的力学传导特性，揭示低模量纳米复合高分子涂层对解决钛种植体生物力学相容性问题的可行性及有效性。(5)申请发明专利3-5项（力争国际专利1项），在SCI刊物发表论文15篇以上，培养博、硕士研究生5-8名，承办或主持召开国际学术会议1-2次；通过与国外研究机构开展合作与人员交流，培养青年学科骨干人才3人以上，吸引留学回国博士、博士后2人以上，研究成果具有国际领先水平。课题三、牙齿硬组织纳米材料自组装再生修复的机理研究课题负责人：陈海峰主要技术骨干：胡秀莲、华红、韩冰、李刚承担单位：北京大学，北京化工大学经费比例：28.33%主要研究内容：(1)牙釉质、牙本质蛋白质介导生物矿化机制的研究：研究纳米羟磷灰石晶体成核、生长及自组装的规律，探讨釉原蛋白、釉蛋白、釉丛蛋白等对牙釉质矿化的影响；探讨牙本质涎蛋白、牙本质磷蛋白等非胶原蛋白对牙本质矿化的影响；运用量化计算和分子设计的方法，通过模拟牙釉质、牙本质生物矿化机制，从理论和实验上探寻新的多肽及非多肽小分子，控制纳米羟磷灰石晶体成核、生长与自组装过程，探索纳米材料在生理条件下诱导并促进牙釉质、牙本质原位再生的作用机制；阐明牙釉质和牙本质蛋白质介导的生物矿化机制；(2)牙釉质、牙本质原位再生修复的研究： 研究牙釉质、牙本质在模拟生理条件下再矿化修复的方法。考察多肽及非多肽分子对牙釉质、牙本质再矿化的作用机制；分析牙釉质、牙本质再生矿化层的物理、化学、力学及生物性能；阐明牙釉质、牙本质再矿化修复的机理；优化并建立牙釉质、牙本质再矿化修复的新工艺及新理论；重点分析类牙釉质、类牙本质再生层与牙体组织的界面结合机制及相关物理、化学、力学及生物性能；运用仿生技术和分子设计方法，将海洋生物多态性粘接蛋白二羟苯丙氨酸（DOPA）基团以及与正常硬组织矿化相关蛋白的有效片段引入仿生粘接剂的制备，从而实现与人体硬组织中的胶原蛋白和无机盐形成多位点化学结合而达到稳固粘接。通过分子结构设计和优化，解决类牙釉质、类牙本质再生层与牙体组织界面结合的力学匹配性，赋予再生修复层长期力学稳定性，延长再生修复层的寿命。(1)牙釉质、牙本质原位再生修复的临床操作方案的研究：建立并优化基于纳米材料的牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论。研究牙釉质、牙本质原位再矿化修复的多种临床应用方式。探讨适合口腔环境临床操作的牙釉质、牙本质再矿化修复的配方和临床应用方式之间的相关性；建立并优化牙釉质、牙本质再矿化修复的临床可行应用方案。预期目标：(1)本课题的总体目标在于实现基于纳米材料自组装技术的牙釉质、牙本质原位再生；从纳米尺度/蛋白质组水平探索纳米材料在牙齿硬组织生物矿化过程中分子作用机制，合理设计和制造更加适合口腔环境临床操作的牙釉质、牙本质原位再生修复的纳米材料配方，建立基于纳米材料的牙釉质、牙本质再生修复的新工艺及新理论；(2)阐明类牙釉质结构、类牙本质结构的生长和组装机制，揭示基于生物矿化原理纳米羟磷灰石晶体可控有序生长、自组装的规律；(3)合理设计和制造更加适合口腔环境下临床操作的牙釉质、牙本质原位再生修复的纳米材料配方和临床应用方式，提出并验证牙釉质、牙本质原位再生修复的临床可行应用方案。(4)发表SCI收录学术论文15篇以上，申请专利4-6项，培养学科交叉型硕士、博士、博士后人才10-15名。课题四、颌骨缺损修复材料纳米化构建与再生重建机制研究课题负责人：王征 主要技术骨干：蔡晴、焦斌、邓旭亮、胡晓阳承担单位：中国人民解放军总医院，北京化工大学，北京大学经费比例：16.67%主要研究内容：(1)研究仿生纳米结构人工细胞外基质的制备技术以脂肪族聚酯和聚酰胺为主要合成高分子，以胶原和明胶为主要天然高分子，以纳米HA等为主要无机成分，以静电纺丝为主要纳米纤维成型技术，结合表面改性、多相成分复合、多级结构建构、生长因子控释技术的研究和复合，获得在多个纳米结构特征（如本体和表面化学组成、形貌、拓扑学结构）存在显著差异的系列仿生纳米结构人工细胞外基质。(2)研究成骨相关细胞在仿生纳米结构人工细胞外基质微环境的体外生物学行为以整合素受体基因表达作为黏着斑形成指标，以Wnt/β-catenin、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和TGF-β/BMPs等成骨分化信号通路为研究对象，利用基因芯片、siRNA等基因工程技术检测成骨分化过程中全基因组差异表达，结合形态学（黏着斑）观察和成骨相关指标（ALP、BMP-2、CTSK和Runx-2）检测，定量研究不同纳米结构特征微环境对成骨相关细胞的黏附、自我更新和成骨向分化的影响，阐明仿生纳米结构人工细胞外基质微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制。(3)研究成骨相关细胞/人工细胞外基质复合物的体内生物学行为以新西兰大白兔、比格犬为实验动物，以优选的仿生纳米结构人工细胞外基质为修复材料，复合成骨相关细胞（MC3T3-1E/BMSCs），通过形态学和组织学观察、X线和CT检查、植入部位β-catenin、MAPK和TGF-β/BMPs蛋白表达分析等手段，对比研究组织工程骨植入颌骨内后诱导和促进颌骨组织再生及整体血管化情况，评价颌骨修复和功能重建的效果，认识细胞/修复材料复合物植入体介导的颌骨组织再生机制。预期目标：(1)通过仿生技术、纳米技术、多相复合、多级结构构建、表面功能化和微图案化等多项技术复合，获得具有仿生纳米结构的新型功能化颌骨修复材料； (2)建立骨修复材料制备工艺参数——纳米结构——细胞行为的定量关联，揭示具有仿生结构支架材料与成骨相关细胞相互作用的实质；(3)阐明纳米结构微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制，在细胞/修复材料复合物植入体介导的颌骨组织再生重建机制方面取得突破；(4)发表SCI收录学术论文15篇以上，申请专利2-3项，培养学科交叉型硕士、博士、博士后人才15-20名。2.课题间关系:基于材料植入进行器官结构和功能再生修复的过程中，生物材料的表面特性是关键因素，对生物体的反应及整个生物学和生物力学愈合过程起决定作用。本项目围绕口腔硬组织修复过程中对自组装和植入式生物材料存在的“（1）具有高生物相容性纳米材料及其界面的设计与制备原理；（2）材料表面纳米结构与细胞、组织之间的相互作用机理；（3）纳米结构对材料/组织界面生物力学匹配性、植入体长期力学稳定性、植入体寿命的影响机制；（4）纳米生物医用材料、材料/组织界面表征新手段、新方法”四个重要科学问题，重点研究“纳米材料在口腔骨、牙再生修复中的生物学过程研究，设立四个课题：“钛种植体表面纳米化促进骨整合的机理研究”，“牙种植体表面低模量纳米材料涂层基础研究”，“牙齿硬组织纳米材料自组装再生修复的机理研究”，“颌骨缺损修复材料纳米化构建与再生重建机制研究”，四个课题针对要解决的科学问题相互关联，形成了有机的整体。 课题一着眼于表面纳米化功能梯度结构实现钛种植体/骨组织界面的快速骨整合；课题二着眼于在牙种植体构建仿牙周膜结构的表面低模量纳米材料涂层，实现牙种植体与牙槽骨界面力学匹配；课题三着眼于仿生矿化，通过纳米材料的自组装来实现牙齿硬组织的再生修复和界面稳固结合；课题四着眼于纳米结构微环境对成骨相关细胞生物学效应的调控，从分子水平认识颌骨组织再生重建机制。四个课题均涉及纳米材料设计、制备与相关生物、医学理论，通过纳米生物材料研究加强对组织发生、生长等生物医学现象的认识，通过生物和医学理论指导口腔纳米生物材料的功能化设计，在关键技术途径的研究上可以相互参考，相互借鉴。因此本项目四个课题均能围绕口腔修复领域，通过各自分工和相互协作，面向提出的口腔关键科学问题。课题之间在研究内容方面相互关联，在项目实施过程中各课题之间又相互沟通相互协作，通过各课题的实施，一定能够顺利完成项目的总体研究目标。 四、年度计划研究内容预期目标第一年1）新型钛合金种植体基材制备，获得牙种植体所需高韧性棒材。2）新型钛合金牙种植体表面采用塑性变形法、化学处理构建纳米梯度功能化表面。3）对钛基体表面进行蚀刻粗糙化处理，优化技术方案和工艺参数。4）研究羟基磷灰石纳米晶体成核、生长及自组装的规律，探讨蛋白质对牙釉质和对牙本质矿化的影响。5）将天然、合成高分子和/或表面接枝改性后无机纳米粒按不同比例混合，静电纺丝制备单组分或多组分复合纳米纤维，制备不同三维拓扑结构的纳米纤维支架。1、制备出牙种植体所需高韧性棒材。2、揭示在表面机械处理、化学处理下，钛合金表面纳米化的过程及其机制。3、优化出钛基体表面粗化处理的最佳工艺技术。4、揭示蛋白质介导磷灰石纳米晶体可控生长与自组装规律；提出牙釉质、牙本质蛋白质介导生物矿化的新模型指导牙釉质、牙本质再矿化修复。5、阐明纤维组成对表面改性效果的影响。6、在SCI刊物上发表论文10-15篇以上，申请发明专利3-5项。培养博硕士研究生4-8名。 第二年1）新型钛合金牙种植体表面水热处理、微弧氧化及后续处理涂层表面纳米结构调控与活化研究。2）钛基体表面功能梯度涂层的制备及表征。3）运用量子化学和分子动力学方法计算模拟设计基于与牙釉质、牙本质矿化相关的蛋白质的多肽片段或非多肽分子，并用多肽合成仪等合成这些模型分子，考察这些分子对纳米羟磷灰石晶体的生长与自组装性质的影响4)采用不同特性纳米纤维膜铺层、模拟体液梯度生物矿化、纳米纤维网络与传统支架成型方法结合等多种手段，进行梯度功能化骨修复材料的设计与制备；1、揭示弧氧化涂层的形成过程。揭示二氧化钛纳米结构材料的形成机理及其诱导磷灰石生长的机制。2、初步制备出组分梯度过渡的功能高分子涂层，以模拟天然牙周膜的性能。3、完成分子设计，完善牙釉质、牙本质蛋白质介导生物矿化的新模型指导牙釉质、牙本质再矿化修复；4、阐明纳米纤维支架对成骨细胞/BMSCs细胞的黏附、增殖、分化程度等体外生物学行为的影响规律；5、在SCI刊物上发表论文10-15篇以上，申请发明专利3-5项。培养博硕士研究生4-8名。第三年1）表面纳米功能梯度新型钛合金牙种植体-骨组织界面的结合机制研究。2）通过化学沉积法在PA涂层表面定向沉积生长HA晶体。3）牙釉质、牙本质在模拟生理条件下原位再生修复及性能评价。对牙釉质、牙本质再生修复层进行表征和分析，评价再生修复层的物理化学、力学性能；运用细胞实验评价牙釉质、牙本质再生修复层的生物安全性。1、探索材料表面纳米功能梯度结构设计对骨整合界面结合特性、细胞选择过程及相关信号因子的影响规律，探讨无机相拓扑形貌对成骨的控制作用。2、在PA高分子涂层表面化学沉积生成一层高生物活性纳米HA晶体。3、建立并优化牙釉质、牙本质原位仿生再矿化的新工艺及新理论。4、 4）成骨分化全基因组表达变化分析，及成骨分化信号通路研究，探索BMSCs成骨分化信号通路的调控机理。阐明纳米结构微环境特征调控成骨相关细胞生物学行为的分子机制；4、在SCI刊物上发表论文10-15篇以上，申请发明专利3-5项。培养博硕士研究生4-8名。第四年1）表面纳米功能梯度化的新型钛合金材料的体内生物学行为研究。2）在化学沉积法定向生长HA晶体过程中，添加适量锶、镁、锌等元素以替代HA晶格中部分钙离子，制备微量元素掺杂改性HA晶体层。3）重点研究牙釉质、牙本质原位再矿化修复的给药方式，设计临床可用的器械和装置重点考察上述配方不同临床应用方式如溶液、糊剂、贴膜等与牙釉质、牙本质的作用机制。4）根据体外生物学研究结果，调整和优选纳米纤维支架制备工艺；研究成骨相关细胞/修复材料复合物植入颌骨内的生物学特性。1、阐明功能梯度的新型钛合金材料调控骨整合相关细胞生物学行为的分子机制。2、组织一次国内学术交流会，交流项目执行中取得的成果。3、完成牙釉质、牙本质原位再生修复的配方和给药方式的设计；提出牙釉质、牙本质原位再生修复临床可行的初步方案。4）建立骨修复材料制备工艺参数—纳米结构—细胞行为的定量关联，揭示具有仿生结构支架材料与成骨相关细胞相互作用的实质。5、在SCI刊物上发表论文10-15篇以上，申请发明专利3-5项。培养博硕士研究生4-8名。 第五年1）总结数据，进行表面纳米功能梯度的新型钛合金材料促进骨整合的体内、体外生物学行为的关联研究；2）通过体外细胞与动物体内实验，对表面有纳米功能梯度涂层的种植体生物学行为进行系列研究3）重点结合动物实验提出牙釉质、牙本质原位再矿化修复的临床可行的应用方案。重点优化牙釉质、牙本质原位再矿化修复的给药方式。4）进行成骨相关细胞在仿生纳米微环境下的体外生物学特性与复合物植入动物颌骨内生物学行为的关联研究1、准备结题，并对课题取得的创新成果组织报奖。2、完成动物实验评价，优化牙釉质、牙本质原位再生临床应用方案3、在细胞/修复材料复合物植入体介导的颌骨组织再生重建机制方面取得突破；4、在SCI刊物上发表论文10-15篇以上，申请发明专利3-5项。培养博硕士研究生4-8名。薃肀莂蒃袂肀肂虿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀肇葿薀罿肆腿莃袅肅芁薈螁膄莃莁蚇膄肃薇薃膃芅荿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃膀膀蚃虿腿节蒆羈芈莄蚁袄芈蒆蒄螀芇膆蚀蚆袃莈蒃蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆袁芃螆螂袀莅蕿蚈衿蒇莂羇羈膇薇袃羇艿莀蝿羆蒂薆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿羄莆蒇袅羃蒈蚂螁羂膈蒅蚇肁芀蚁薃肀莂蒃袂肀肂虿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀肇葿薀罿肆腿莃袅肅芁薈螁膄莃莁蚇膄肃薇薃膃芅荿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃膀膀蚃虿腿节蒆羈芈莄蚁袄芈蒆蒄螀芇膆蚀蚆袃莈蒃蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆袁芃螆螂袀莅蕿蚈衿蒇莂羇羈膇薇袃羇艿莀蝿羆蒂薆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿羄莆蒇袅羃蒈蚂螁羂膈蒅蚇肁芀蚁薃肀莂蒃袂肀肂虿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀肇葿薀罿肆腿莃袅肅芁薈螁膄莃莁蚇膄肃薇薃膃芅荿螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁薇蚇袇肃莀薃羆膅薆葿羆芈荿螇羅羇膁螃羄膀莇虿羃节芀薅羂羂蒅蒁羁肄芈螀羀膆蒃蚆肀芈芆薂聿羈蒂蒈肈肀芅袆肇芃薀螂肆莅莃蚈肅肅薈薄蚂膇莁蒀蚁艿薇蝿螀罿荿蚅蝿肁薅薁螈膄莈薇螈莆膀袆螇肆蒆螁螆膈艿蚇螅芀蒄薃螄羀芇葿袃肂蒃螈袂膄芅蚄袂芇蒁蚀袁肆芄薆袀腿蕿蒂衿芁莂螁袈羁荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇肅蒀袇袇莀莆蒄罿膃节蒃肁荿薁蒂螁膁蒇蒁袃莇莃薀羆膀艿薀肈羃薈蕿袈膈薄薈羀肁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅薀薄羇肇蒆蚄聿芃莂蚃螈肆芈蚂羁芁芄蚁肃膄薃蚀螃荿葿虿袅膂莅蚈羇莈芁蚈肀膁蕿螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅肄羂莇螄螄芇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肁肈莄袁螀芄芀袀袂肇薈衿羅节蒄袈膇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