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闫青青论文---饮茶对几种铁化合物铁生物有效性的影响

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河南科技大学毕业设计(论文)饮茶对几种铁化合物铁生物有效性的影响姓名:闫青青院系:动物科技学院专业:动科本081指导老师:何万领2010年5月30日2222 毕业设计(论文)任务书(指导教师填表)填表时间:2010年1月15日学生姓名闫青青专业班级08动科1(本)指导教师何万领课题类型论文设计(论文)题目饮茶对几种铁化合物铁生物有效性的影响主要研究内容1.将硫酸亚铁﹑EDTA-FeNa和柠檬酸亚铁按40mg/kg添加入日粮,饲喂SD雌性大鼠,并与每天给大鼠饮龙井2.心脏采血,屠宰解剖老鼠。3.测定血液血红蛋白等生理指标,用试剂盒测定血清总铁结合力﹑血清总铁﹑肝脏和肾脏铁含量。主要技术指标(或研究目标)本实验通过测定SD大鼠血液红细胞数﹑白细胞数血红蛋白等生理指标,用试剂盒测定血清总铁血清总铁肝脏和肾脏铁含量等来评价饮茶对几种铁化合物铁生物有效性的影响。要求试验设计严谨完善,试验过程认真谨慎,所测数据要有一定的准确性和说服力。同时对学生提出以下要求:1.掌握科技文献的查阅,至少查阅20篇参考文献;2.完成一篇3000字左右的综述;3.翻译1篇相关的英文科技文献,不少于10000字符。4.撰写毕业论文,不少于10000字。进度计划1.2010年1月下达毕业设计(论文)计划任务书2.2010年2月查资料、撰写开题报告3.2010年3、4月预备试验,正式试验,4月底结束试验4.2010年5月整理材料、数据分析、完成论文初稿5.2010年6月修改论文,迎接答辩主要参考文献1.郭丙莹,程启坤,茶汤组分与金属离子的螯合性能[J].茶叶科学,1994,11(2):139-1442.周张章,赵国华,周才琼,等铁强化剂的应用现状[J].中国食品添加剂,2005,1:95-983.SamirS,BrittmarieS,MajaBT,etal.Greenteaorrosemaryextractaddedtofoodsreducesnonheme-ironabsorption[J].AmericanJClinNutr,2001,73(3):607-612教研室主任签字:年月日22 22饮茶对几种铁化合物铁生物有效性的影响摘要试验选用84只生长健康,体重均匀的SD大鼠,随机分A、B、C、D、E、F、G七组,每组12只,A组饲喂基础日粮,饮用去离子水,B、C、D组在基础日粮中分别添加40mg/kg硫酸亚铁﹑EDTA-FeNa﹑柠檬酸亚铁,饮用去离子水,E、F、G组在B、C、D组日粮基础上,饮用去离子泡制的龙井茶。通过测定SD大鼠血红蛋白含量、血清总铁结合力和血清总铁含量及肝脏和肾脏中铁、锌含量,评价饮茶对铁生物有效性的影响。试验结果表明:(1)EDTA-FeNa铁生物有效性高于硫酸亚铁和柠檬酸亚铁,但差异不显著;(2)饮茶对几种铁化合物的铁生物有效性均有抑制作用(P>0.05),且对硫酸亚铁和柠檬酸亚铁的抑制作用大于对EDTA-FeNa的抑制。总之,不同铁化合物其铁生物有效性存在差异,以EDTA-FeNa生物有效性最好;饮茶可抑制铁的生物有效性,因此,建议补铁和饮茶应间隔一定时间进行。关键词:茶,SD大鼠,铁化合物,铁生物有效性2222 TEAFORMANYKINDSOFIRONCOMPOUNDSTHEEFFECTIVENESSOFTHEIMPACTOFBIOTECHNOLOGYABSTRACTThetestusedtogrowhealthyandeventheSDrats,inarandomA,B,C,D,E,F,Gsevengroup,eachgrouprepeatingthreea,basedonagroupforfood,drinkingtodeionizedwaterB,C,Donthebasisofthegrainofadding40mg/kgtheironandsulphuricacid-whichEDTA-FeNa,citricacidtheiron,anddrinktodeionizedwaterE,F,GandgroupB,CandDonthebasisoffoodanddrinkthedeionizedoflongjingtea.BymeasuringtheSDratshemoglobincontentofserum,serumtotalofironandsteelbondknownasliverandkidney,iron,zincandassessmentcontenttothebiologicalavailabilityoftea.Testresultsindicatethat:(1)EDTA-FeNabiologicalavailabilitythanironandsteelandsulphuricacid-whichcitricacidtheiron,butnosubstantialdifference.(2)Teaformanykindsofironcompoundironbiologicalavailabilityofrestraining(p>0.05)andsulphuricacid-whichcitricacidtotheironandsteel,thedisincentivetoworklargeEDTA-FeNaofvictimization.Inshort,someofthecompoundbiologicalavailabilitydifferencesinbiologicalavailabilityEDTA-FeNabesttocontainiron.Teabiologicalavailability,therefore,suggestedthattheironandteashouldbeatatime.KEYWORDS:Tea,SDrats,Ironcompounds,Ironbioavailability22 目录1前言11.1铁的概述11.1.1铁的理化性质11.1.2铁的来源11.1.3铁的吸收机制11.1.4影响铁吸收的因素21.2 国内外研究进展21.2.1饮茶对铁化合物性能的影响21.3本试验研究的目的与意义31.3.1研究的目的31.3.2研究的意义32材料与方法42.1试验动物42.2试验材料42.3试验日粮42.4试验仪器42.5试验的时间和地点42.6试验设计52.7取样及样品处理52.8指标测定方法52.8.1血红蛋白含量52.8.3血清总铁含量的测定52.8.4肝脏和肾脏铁含量的测定52.9数据处理63结果622 3.1饮茶对补铁SD大鼠血液铁指标的影响63.2饮茶对补铁SD大鼠肝脏、肾脏铁锌含量的影响74分析与讨论84.1铁化合物种类对其生物有效性的影响84.2饮茶对铁生物有效性的影响84.3补铁与饮茶饮食合理性探讨95结论9参考文献11致谢12外文资料译文1422 1前言1.1铁的概述1.1.1铁的理化性质铁是一种光亮的银白色金属。化学符号为Fe,原子序数是26,原子量为55.847,处于元素周期表的4周期Ⅷ族,和钴、镍一齐称为铁系元素。铁的密度为7.86g/cm3。熔点1535℃,沸点2750℃,有好的延展性和导热性,也能导电。纯铁既能磁化,又可去磁,且均很迅速。电离能为7.870电子伏特。铁化学性质活泼,为强还原剂,在室温下可慢慢置换出水中的氢:3Fe+4H2O=Fe2O3+4H2。铁以氧化作用状态由-2到+6价的范围内存在,在水溶液中常以化合价+2和+3的形式存在。在生物系统中,氧化状态主要限于Fe2+、Fe3+及Fe4+。易溶于稀酸,在浓硝酸中能被钝化。加热时均能同卤素、硫、硅、碳、磷等化合。1.1.2铁的来源在自然界,铁广泛存在于土壤、大气、水及动植物体内。铁在地壳中的含量约为5%,占第四位;在金属中仅次于铝,占第二位。地球岩心主要由铁组成,在整个地球中铁是丰度最高的元素。在地壳中铁通常以化合物状态存在。含铁的矿物有几百种,主要的有赤铁矿(Fe2O3)、褐铁矿(Fe2O3·3H2O)、磁铁矿(Fe3O4)和菱铁矿(FeCO3),它们多是容易还原的氧化物矿。其他如黄铁矿(FeS2)、钛铁矿(FeTiO3)和铬铁矿[Fe(OrO2)2]则是同时提取铁和硫、钛、铬的矿物。生物体中也含铁,每人平均含铁量为4.5g左右,地下水中也含铁。植物的铁含量一般为100-800mg/kg,有时会超过2000mg/kg,而以100-300mg/kg之间的为最多。1.1.3铁的吸收机制人体膳食中铁有二种形式:血红素铁和非血红素铁,两者在吸收机制上存在明显不同。血红素铁主要来源于肉类产品和动物血液。进入肠道内的血红素与球蛋白分离以完整的铁卟啉结构被小肠粘膜细胞吸收。目前并不明确血红素铁通过十二指肠粘膜刷状缘吸收进入肠粘膜细胞的确切机制,有研究者认为血红素可通过被动扩散进入粘膜细胞。周淡宜(2004)对缺铁大鼠研究表明,小肠刷状缘血红素的结合度与血红素的吸收均有增加,这一结果提示血红素铁的吸收是一个主动的调节过程[1]。血红素铁是通过肠粘膜细胞膜上的血红素转运体完成,即血红素在肠粘膜上皮细胞上被存在于细胞内的血红素加氧酶(hemeoxygenase-1,HO-1)作用下,释放出游离态的铁而被吸收[2]。非血红素铁是植物性食物中普遍存在的一种铁形态,通常以Fe3+的形式与谷物蛋白质、氨基酸、植酸和有机酸等结合形成络合物,以Fe2+22 的形式存在较少。另外,常用的铁营养强化剂均为非血红素铁。非血红素铁在肠道的吸收分为2个途径:膳食中的二价铁可被上皮细胞粘膜上的二价金属转运蛋白(Divalentmetaltransporter-1,DMT-1)接收转运到肠上皮细胞内的铁贮池内或一部分参与形成细胞内的铁蛋白[3]。张春飞(2004)等研究表明三价铁可在上皮细胞粘膜上的十二指肠细胞色素B(DuodenalCytochromeB,DcytB)的还原作用下形成二价铁,再由DMT-1将二价铁转运入细胞内[4]。1.1.4影响铁吸收的因素血红素铁和非血红素铁在肠道吸收机制上存在不同,影响吸收的因素上也不相同,研究认为,血红素铁可直接以血红素的方式被吸收,不会受到膳食因素的影响。非血红素铁在吸收的过程中却受到膳食中诸多因素的影响,这也是植物性食物铁利用率低的重要原因。研究表明,在植物性膳食中存在铁吸收促进因子和抑制因子,如半胱氨酸[5]、部分有机酸[6]、抗坏血酸[7]、某些糖类[8]等对铁吸收均有不同程度的促进作用;而植酸[9]、单宁酸[10]、植物纤维[11]、多酚类[12]、磷[13]、草酸[14]、镁[15]、、植物蛋白[16]等却对铁吸收有不同程度的抑制作用。霍军生等(2001)在玉米粉中添加210mg半胱氨酸或相似量的半胱氨酸-缩氨酸复合类似物后。玉米粉中铁生物有效性均提高了2倍[17]。付会堂等(1998)利用基因工程技术,成功地使水稻籽粒中半胱氨酸水平提高了7倍,并表现出铁生物有效性显著提高[18]。蒋彬等(2002)研究各种有机酸对二价铁和三价铁吸收的影响表明,酒石酸、苹果酸、琥珀酸、反丁烯二酸对二价铁和三价铁均有不同程度的促进作用;柠檬酸、草酸、乳酸对二价铁有不同程度的抑制作用,对三价铁吸收却有促进作用;丙酸和醋酸对二价铁吸收有明显促进作用,对三价铁吸收影响不大[19]。江川等(2004)研究抗坏血酸对铁吸收的影响表明,维生素C对铁吸收有明显的促进作用,并随着VC/Fe摩尔比例的增加,铁生物有效性呈直线上升。并且,抗坏血酸对三价铁的促进作用高于二价铁。这说明抗坏血酸的还原作用使更多的三价铁还原为二价铁,从而提高铁的吸收[20]。顾德法等(2003)研究植酸、单宁酸、锌对铁吸收的影响表明,植酸和单宁酸对铁吸收有很强的抑制作用。当植酸/铁摩尔比为10:1或单宁酸/铁摩尔比为1:1时具有最大的抑制效果;当Zn/Fe摩尔比分别为0.5:1和1:1时,铁吸收分别降低了57%和80%[21]。1.2 国内外研究进展1.2.1饮茶对铁化合物性能的影响22 饮茶是包括我国在内的世界许多国家的重要生活文化之一,尤其是我国人民喜欢在吃饭过程中或饭后饮茶。而茶叶中的化学成分有可能影响到铁的吸收。本实验研究饮茶对铁生物有效性的影响,为合理饮茶和预防机体缺铁提供理论依据。目前,由于各种原因,铁缺乏成了发展中国家最常见的营养素缺乏症,也是发达国家目前主要的微量元素缺乏症之一。韩垄植(2003)研究表明对于缺铁性贫血患者给予补充铁剂进行治疗是非常必要的。铁是人体必需元素,铁不足将导致缺铁性贫血。人体摄入铁的食物来源主要是肉,鱼,豆类及蔬菜等。饮茶与铁营养关系较为密切[22]。DislerP等(1975)的研究得出;进食前后大量饮茶可导致铁的吸收率下降达60%。还发现血清中铁蛋白水平与进餐时饮茶呈负相关[国内也有因过度饮茶而导致缺铁性贫血的病例发现[23]。孙静等(2003)通过对国外文献的综述表明,饮茶对铁储存充足(以血清铁蛋白浓度为指标)的西方人群的铁营养状况影响不大,而对铁营养状况处于临界水平的人群,饮茶与铁营养状况似乎呈负相关[24]。综合各方面资料,我们认为茶中酚类物质能与三价铁离子络合成不溶性物质,这是导致饮茶抑制铁吸收的主因。然而这种反应只对非血红素铁起作用,对血红素铁不起作用。此外,由于维生素B12与红血细胞形成有关,而茶多酚与维生素B12之间存在络合现象,此也可能是助长缺铁性贫血的机理之一。另一方面,茶叶中还存在大量维生素C等成分,它们有促进铁吸收的作用。刘志伟等(2004)利用血红素再生法以硫酸亚铁(FeSO4)为阳性对照品研究了TPS·Fe在缺铁性贫血大鼠体内的生物利用率以及不同给药对大鼠组织内铁锰铜锌含量水平的影响。分别以Hb、血红蛋白总铁、血清铁含量为评价指标,以FeSO4的生物利用率为100%时,TPS·Fe的生物利用率为116%之间,说明TPS·Fe相对FeSO4是一种较好的补铁剂[25]。1.3本试验研究的目的与意义1.3.1研究的目的通过在日粮中添加硫酸亚铁,柠檬酸亚铁等铁制剂和饮用龙井茶叶泡制的茶,测定补铁SD大鼠血清、肝脏、肾脏中铁的含量和红细胞数﹑白细胞数﹑血红蛋白数,评价饮茶对SD大鼠铁有效性的影响,以揭示饮茶对铁吸收的影响。1.3.2研究的意义铁缺乏和缺铁性贫血是我国乃至世界普遍存在的营养问题,最近开展的中国居民营养与健康状况调查报告显示,全国有50%缺铁,其中两亿多人表现出缺铁性贫血症状。而导致缺铁的原因除膳食中铁含量不足外,最重要的是食物中化学成分可严重降低铁的生物有效性。本试验利用SD大鼠研究饮茶对几种铁化合物铁生物有效性的影响,这对合理饮茶和选用适宜的铁强化剂具有现实意义,并可进一步丰富铁生物有效性研究的基础理论。2材料与方法2.1试验动物SD大鼠购自河南科技大学医学院实验材料中心。22 2.2试验材料龙井茶购自杭州英仕利生物科技有限公司;七水硫酸亚铁(分析纯)购自天津市北方天医化学试剂厂,柠檬酸亚铁(分析纯)和EDTA-FeNa(分析纯)均购自Sigma公司。2.3试验日粮表1SD大鼠基础日粮组成和营养水平成分Ingredients含量Content营养水平Nutrientlevels含量Content玉米Corn35.0粗蛋白质Crudeprotein20.8大豆饼粕Soybeanmeal30.0粗脂肪Crudefat4.1麦麸Wheatbran21.0粗纤维Crudefibre5.8小麦Wheatstarch8.0粗灰分Crudeash3.5酵母粉Yeastmeal1.0能量Grossenergy(kJ/kg)1637.5食盐NaCl1.0豆油Soybeanoil1.5矿物元素Mineralmixture1.5维生素Vitaminmixture1.0合计100注:每千克日粮中含矿物元素:磷酸氢钙17g;铁0mg;铜12mg;锌30mg锰72mg;硒0.1mg;碘0.5mg。每千克日粮中含维生素:VA4000IU;VD1200IU;VE6mg;VB11.4mg;VB23mg;VB61mg;泛酸7.5mg;生物素150µg;VB1210µg;胆碱500mg。2.4试验仪器电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,Agilent7500a,美国)XD811生化分析仪(上海迅达医疗仪器公司)752紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)数显恒温水浴锅(金坛市晓阳电子仪器厂)等。2.5试验的时间和地点本试验的饲养试验于2010年4月14日至5月14日在河南科技大学试验牧场进行。铁含量的测定试验于5月15日至5月20日在河南科技大学动物科技学院生理生化实验室进行。2.6试验设计选84只生长健康、体重均匀的雌性SD大鼠随机分成A、B、C、D、E、F、G7组,每组设3个重复。A组为对照组,饲喂基础日粮(不加铁),22 饮水为去离子水,B、C、D组分别在基础日粮中添加40mg/kg(以铁计)硫酸亚铁,EDTA-FeNa和柠檬酸亚铁,饮用去离子水,E、F、G组日粮组成分别与B、C、D三组相同,但饮用水为用去离子泡制的龙井茶。采用塑料筐饲养,上层为不锈钢网,饮水瓶为塑料质地,为防止铁的污染,凡SD大鼠饲喂用具统一用稀盐酸过夜浸泡,以去处铁的污染。试验期间管理条件相同,每周称重一次,试验期为30天。2.7取样及样品处理试验结束后,禁食12h称重,心脏采血立即用血细胞分析仪测定血红蛋白含量;其他血样品于2000r/min离心10min,取血清保存在-20℃冰箱中备用。取血清用半自动生化分析仪测定血清总铁结合力和血清铁的含量。屠宰解剖取肝脏和肾脏,称取一定重量湿法消化后,用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定铁的含量。2.8指标测定方法2.8.1血红蛋白含量血样取出后,加抗凝剂,混匀后立即用血细胞分析仪测定血红蛋白含量。2.8.2血清总铁结合力的测定采用南京建成生物工程研究所血清总铁结合力测定试剂盒测定。其测定原理为:血清总铁结合力(TIBC)通常情况下,仅有1/3的运铁蛋白与铁结合。在血清中加入已知过量的铁标准液,使血清中全部的转运铁(Tf)与铁结合达到饱和状态,再用吸附剂(轻质碳酸镁)除去多余的铁。再按测定血清铁的方法测定铁的含量,其结果为总铁结合力,如再减去先测的血清铁,则为未饱和铁结合力(UIBC)。计算公式:总铁结合力=(R-B/S-B)×标准液浓度(1㎎/L)×样本测试前的稀释倍数(2)R:代表测定管B:代表空白管S:代表标准管2.8.3血清总铁含量的测定采用南京建成生物工程研究所血清总铁结合力测定试剂盒测定。其测定原理为:在酸性溶液和还原剂的作用下,使运铁蛋白中的铁与蛋白分离,使血清中的高铁还原成亚铁。后者与双吡啶结合成粉红色的絡何物。在一定范围,铁离子的多少与色泽呈正比。计算公式:血清铁含量=(R-B/S-B)×标准液浓度(2㎎/L)R:代表测定管B:代表空白管S:代表标准管22 2.8.4肝脏和肾脏铁含量的测定把大鼠肝脏于烘箱内烘干至恒重,磨碎,准确称取0.01g,置于50mL聚四氟乙烯管中(特福龙管),用5mL移液枪准确吸取盐酸(光谱纯)4.5mL,混匀,静止过夜后,加入0.5mL双氧水(分析纯),用微波消解仪进行消化,消化具体程序为60℃30min、115~120℃2h、125℃30min,消化液置于50mL塑料瓶中,用去离子水定重25g。用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定其铁和锌的含量。2.9数据处理采用Excel软件进行初步分析后,用SPASS13.0版统计软件中的ANOVA模块进行单因素方差分析,并用LSD法多重比较,所有结果均用“平均数±标准差”表示。3结果3.1饮茶对补铁SD大鼠血液铁指标的影响由表2结果可知,与对照组相比,添加铁化合物使SD大鼠血红蛋白含量显著增高(P<0.05),B、C、D饮茶组血红蛋白的含量分别增加了30.7%、46.14%、34.7%。而以添加EDTA-FeNa组血红蛋白的含量最高。E、F、G饮茶组与B、C、D添加铁强化剂组比较,血红蛋白的含量分别降低了17.4%、22.5%、13.0%。表明饮茶对饲喂几种铁化合物日粮的SD大鼠体内血红蛋白含量的影响显著(P<0.05)。血清总铁结合力差异无显著性(P>0.05)。血清铁含量中表明,C与F差异显著,其它组中的血清铁含量差异不显著(P>0.05)。表2SD大鼠血红蛋白、血清总铁和血清总铁结合力组别血红蛋白含量(g/L)血清总铁结合力(mg/L)血清铁含量(mg/L)A95.0±4.10c26.08±6.30ab6.60±1.03bB137.1±3.53ab27.00±6.505ab8.69±1.40abC176.4±3.55a31.33±7.55ab9.65±1.52abD145.5±8.95ab29.74±7.16ab8.43±1.32abE113.2±6.12bc30.19±7.335ab8.72±1.37abF136.7±2.56ab30.19±7.27ab10.01±1.58aG126.6±4.81bc27.44±7.07ab9.04±1.42ab注:同列数据肩标字母不同者表示差异显著(P<0.05)。下同。22 3.2饮茶对补铁SD大鼠肝脏、肾脏铁锌含量的影响饮茶对补铁大鼠肝脏、肾脏铁、锌含量的影响见表3、图1、2。与对照组相比,添加铁化合物使大鼠肝脏和肾脏中铁含量有所增高,B、C、D组分别提高了71.12%(P<0.05)、87.1%(P<0.05)、48.87%(P>0.05);4.7%(P>0.05)、92.7%(P<0.05)、10.20%(P>0.05)。与铁化合物组相比,饮茶可降低大鼠肝脏和肾脏铁的含量,E、F、G组分别降低了15.1%、20.2%、26.67%;18.49%、30.19%、24.78%。表3SD大鼠肝脏和肾脏中铁锌含量(mg/kg鲜组织样)项目肝脏肾脏铁锌铁锌A85.02±10.34b28.63±1.52a60.47±4.36b19.20±2.15aB145.49±11.69a27.58±0.86a63.34±5.19b17.75±0.76aC159.07±13.22a28.77±1.11a116.67±10.33a23.33±0.94aD126.57±9.64ab26.73±1.34a66.64±8.11b19.82±1.83aE123.57±10.2ab23.34±1.14a51.63±3.27b20.67±1.85aF126.86±7.54ab25.42±2.06a81.45±5.22ab22.93±2.10aG92.55±3.53b23.94±2.17a50.13±2.19b19.48±1.75a图1SD大鼠肝脏铁含量图2SD大鼠肾脏铁含量22 4分析与讨论4.1铁化合物种类对其生物有效性的影响铁化合物种类不同对铁生物有效性有一定的影响。Ammerman(1995)对几种铁化合物生物有效性研究表明,柠檬酸铁、延胡索酸亚铁、葡萄糖酸亚铁的铁生物有效性与硫酸亚铁相等[26]。动物可以较好的利用氯化亚铁,但几乎不能利用氯化铁;周桂莲三氧化二铁生物有效性极低[27]。Cao(1996)对肉仔鸡的研究表明,蛋氨酸铁的生物有效性只有硫酸亚铁的68%[28]。徐建雄(1992a,b、1994)在猪的研究中表明,蛋氨酸铁效果优于硫酸亚铁[29]。本试验利用SD大鼠研究硫酸亚铁、EDTA-FeNa、柠檬酸亚铁生物有效性表明,EDTA-FeNa的生物有效性较高,硫酸亚铁和柠檬酸亚铁的生物有效性较低。4.2饮茶对铁生物有效性的影响茶叶自远古以来均被推崇为天然的饮品,具有营养价值,又有药理和保健作用。古代的人们已经认识到饮茶对人体的健康有养生,提神,健脑,消食等作用。但是现在随着人们对饮食研究表明,茶叶中也含有某些成分会影响人体营养物质的吸收和利用。周才琼等(1995)研究表明,茶叶中的鞣酸可与铁制剂中的铁离子结合,从而影响铁离子的吸收。茶叶中富含鞣酸,植酸等化合物,可与三价铁形成不溶性沉淀,鞣酸铁等,不能吸收而被排除体外,致铁吸收减少。另外大量鞣质抑制胃肠活动,胃酸分泌减少,铁的摄入相应减少。由于铁的摄入吸收减少而导致缺铁性贫血[30]。罗玉坤(1998)研究,茶水是含多酚较多的饮料,多酚类通过不溶的复合物而降低非血红素铁的生物利用率[31]。杨建春(2003)将茶与FeSO4、EDTA-NaFe分别制成水溶液,研究人体铁吸收表明,茶使FeSO4的吸收率下降至不足1%,而对EDTA-NaFe的吸收则没有明显作用,说明EDTA-NaFe可保护铁离子不被植酸络合,从而保护由此造成的铁吸收率的降低[32]。本实验利用SD大鼠研究饮茶对硫酸亚铁、EDTA-FeNa、柠檬酸亚铁生物有效性影响的结果表明茶叶中含有的一些植酸,鞣酸等,对铁生物的有效性具有抑制作用,其中影响较大的是硫酸亚铁,其次是柠檬酸亚铁,对EDTA-FeNa影响最小。4.3补铁与饮茶合理性探讨茶叶中存在大量的多酚类、生物碱等物质,它们在一定条件下会与同时摄入体内的其他营养物质相互影响或发生反应。从而影响其活性或吸收,有的还可能导致毒副反应。本试验表明,补铁同时伴随饮茶可降低铁的生物有效性,且这种抑制主要表现在对溶解性好、结合能力差的铁化合物的作用。因此,本试验建议补铁的时候应避免饮茶,或间隔一定时间再饮茶;其次,补铁时最好选择螯合态的、化学性质相对稳定的铁化合物作为补充剂。22 5结论本试验利用SD大鼠研究饮茶对几种铁化合物铁生物有效性的影响,得出如下结论:(1)硫酸亚铁的生物有效性较差,其次是柠檬酸亚铁,EDTA-FeNa生物有效性最好。(2)饮茶可降低补铁的效果,尤其是对硫酸亚铁的抑制作用最强。22 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致谢本论文是在何万领老师的悉心指导和亲切关怀下完成的,从论文选题、资料搜集、方案设计、实验实施,一直到最后的论文撰写等各方面都给予了关键性的指导和帮助。导师渊博的知识、求实创新的治学思想、严谨的工作作风使我受益匪浅。至此论文完成之际,谨向何老师表示衷心的感谢和崇高的敬意。在实验及论文写作过程中,何万领博士严谨的治学态度、无私的指导和帮助给了我莫大的感动。另外,邓雯、李晓丽、文凤云、李文巧等老师也给我提供了不少帮助,在此一并表示诚挚的谢意。此外,本实验还得到了实验室多位同学的帮助,在此感谢户如霞、陈晓洁、金悦新、王巧丽等同学给予我无私的关心和支持,衷心地祝愿大家前程似锦。22 外文资料译文通过利用体外消化或Caco-2细胞模型研究植酸鞣酸氯化锌对铁吸收的抑制作用RAYMONDP.GLAHN*ANDGARYM.WORTLEY摘要本文主要运用体外消化或Caco–2细胞模型研究植酸鞣酸氯化锌对铁吸收的抑制作用。在测定植酸鞣酸氯化锌对铁吸收的抑制作用中发现植酸鞣酸可以增加每摩尔三氯化铁的吸收。Fe与植酸的比例以1:10的比例添加可以最大限度的抑制铁的吸收,在一次降低铁吸收的实验中发现在降低了铁的含量的植酸但增加Fe:植酸的比例到1:3显示有许多铁被溶解在植酸中,但是利用率却很低。正如人类研究,血红素铁比非血红素铁较少的被植酸抑制。单宁酸对非血红素铁的吸收是一种多抑制剂。在1:1的比例或更低的比例显示将会有97.5%铁的吸收被抑制。将氯化锌以1:0.5和1:1比例添加抑制铁吸收的分别为57%和80%。利用这个模型体系研究表明这几种化合物影响铁吸收的关系在人类中得到广泛应用。这次研究显示的信息说明饮食中还有许多因素可能影响铁的吸收。关键词:铁,锌,生物利用率,植酸,鞣酸,体外吸收,Caco-2细胞1引言Glahnetal通过体外吸收或Caco–2细胞模型的发展表示它是预测人类铁收收迅速而准确的工具。它利用人类的一般肠上皮细胞和通过CaCo-2细胞营养吸收相结合模仿人类吸收。CaCo-2细胞模型为了测得食物中铁的有效性将铁蛋白作为铁吸收的标记物。在使用铁蛋白的标记物时不需要放射性同位素标记因此操作者可以在许多领域运用。总而言之,Caco–2细胞消化模型试验。(1,2)显示的承诺作为可以预测人类铁的吸收一种成本效益快速工具。它与细胞模型结合,人体消化吸收养分1人类肠上皮细胞系。该模型已专门开发了从用标记Caco-2细胞铁蛋白的形成铁的吸收测量食品铁可用性中铁蛋白的形成射性同位素食品标签否定需要更为有用从而使其为广泛的用户使用。一般来说,该系统不能用于体内研究试验,提供一个食品基质在了解影响铁可用性具体因素。22 由格拉恩等在开发体外细胞培养模型digestion/Caco-2。(1,2)显示的承诺作为可以预测人类铁的吸收一种快速,成本效益工具。它与在Caco-2细胞模拟结合,人体消化吸收养分1人类肠上皮细胞系。该模型已专门开发了从用标记Caco-2细胞铁蛋白的形成铁的吸收测量食品铁可用性。中铁蛋白的形成,对放射性同位素食品标签否定需要更为有用从而使其为广泛的用户使用。一般来说,该系统用于人体试验并不可行或可负担的研究体内。正如任何体外模型,根据大量的人力与定性研究类似的结果。这个模型系统已经证明,系统的验证相对人体试验是至关重要的。例如,从牛肉消化吸收铁,鸡和鱼从消化含酪蛋白是300-400%的铁的吸收(1)。在其他研究中,研究人员证明人奶的比一个婴幼儿配方奶粉中铁的供应要好(3)。在加强肉类和抗坏血酸对铁有效性影响也在这个系统中得到证明(2,4,5)。此外,在比较一些商业铁补充剂,在体外铁可用性从多糖铁复合和硫酸亚铁编制了质量相同的严密匹配人体研究(5,6)。两者合计,上述研究传授在使用该系统的信心,丰富的文献铁与人类提供类似的效果。这个模型系统中的应用是多方面的。它可以用来改善食品的生物商业铁产品可利用,如现成的即食早餐麦片,婴儿谷类食品,和婴儿方等,使用由确定大宗品种相对铁可用性从而找出或改善营养品质差的如粮食作物水稻,小麦,玉米,豆类,可作为筛检工具。在除了评估个别食品,该系统可用于从膳食或特殊食物和饮料确定铁有效性,其中的组合是无穷无尽的。它代表了手段,系统研究或屏幕等诸多因素,化合物,或条件,从而改进和提高设计较昂贵的和明确的人体试验。为所有这些应用程序,必须适当数额食品和铁在设计时考虑实验以免系统超载。一般来说,这个系统的开发条件标准是小改变铁的可用性和处理能力广泛食物的范围非常敏感的(1-5)。本研究的目的是提供信息抑制剂对铁的吸收(即,植酸已知抑制剂的影响酸,单宁酸,锌)在Caco-2细胞铁吸收这个模型系统和他们的亲属效价在目前的食物或其他成分的情况下餐矩阵。这个模型这些影响对其他用户是有价值的文件,因为它会帮助提供一个食品基质在了解影响铁可用性具体因素。材料与方法化学品,酶和激素。除非另有说明,所有化学品,酶和激素均购自Sigma化工有限公司(圣路易斯,密苏里州)。三氯化铁来源的免疫球蛋白是1040铁/毫升溶液,1%盐酸(西格玛的I-9011)。细胞培养Caco-2细胞,是根据美国类型文化收藏(罗克维尔,医师)在1722 日通过和使用通过实验,在25-33。在细胞接种密度为50000胶原蛋白处理的6孔板cells/cm2(中光学集团,剑桥,马)。这些细胞是生长在贝科的改良伊格尔中等(Gibco公司,大岛,纽约州)的10%容量/胎小牛血清(Gibco公司),25mmol/L的培养基含,抗真菌抗生素和1%溶液(Gibco公司)。这些细胞被保存在一个孵化器以5%的二氧化碳在37°C和95%恒湿空气的氛围,培养基改变每2天。这些细胞被用来在铁摄取实验在播种后13天。在这种情况下,金额细胞蛋白测定每个井的发现是高度一致从好到好每个培养板。体外消化猪胃蛋白酶,胰酶,胆汁提取物的使用。进一步筹备的胃蛋白酶,胰酶,胆汁提取物进行如下。不久之前使用,胃蛋白酶0.2克溶于5毫升0.1mol/L的盐酸,添加至2.5Chelex-100,以及旋转滴度动摇桌面板振动筛30分。被拆除的Chelex过滤从胃蛋白酶的解决方案。增加5毫升0.1摩尔/L的盐酸添加到列,滤液收集到的胃蛋白酶的解决方案。最后的总体积的胃蛋白酶溶液洗脱为8毫升。对于肠道消化,0.05克胰酶和0.3克胆汁提取物溶解在25毫升0.1摩尔/L的碳酸氢钠。Chelex-100增加了,由此产生的混合物为30分钟在桌面旋转盘动摇振动筛效价。当时的混合物倒入直径1.6厘米到1过滤列筛选出Chelex。另外添加10毫升0.1摩尔/L的碳酸氢钠到一个列,胰酶/胆汁的滤液收集进入解决方案。最后的胰酶/胆汁溶液总额27毫升。制备的胃蛋白酶和胰酶/胆汁解决方案通过上述方法不影响酶的活性。消化性溃疡和肠道消化进行了一个摇摆平台振动筛在37°C的5%CO2和95%的空气气氛保持不变湿度。孵化器的面。肠道消化,开展了上院一个在6孔板两院制,与细胞单层重视对下院(图1)底部表该上议院通过拟合形成底部1appropriatesizedTranswell小插入环的一15000透析膜留分子量,该去离子水膜浸泡至少12小时后才能使用。透析膜的地方添加了一个硅胶环。透析膜固定后插入在环,整个成分在70%乙醇消毒,然后浸泡在无菌水,直至使用。要开始消化,每个样品放置在一个在pH值2。50毫升螺丝帽文化管,含有1022 毫升的130mmol/L的NaCl,5mmol/L的氯化钾,(.05mM的管道1.0mol/L的调整盐酸)。然后,0.5毫升的胃蛋白酶溶液中加入。该管上限,水平放置,并在60分钟的摇晃孵育振动筛(每分钟55振荡)。对于肠道消化步骤,样品的pH值。提高到到pH值6,加入1mol/L的碳酸氢钠滴。然后,2.5毫升的胰酶/胆汁提取物的混合物中加入。pH值调整为pH值七,1mol/L时碳酸氢钠,音量被带至15毫升的120mmol/L的氯化钠和5mmol/L的氯化钾。这种混合物被称为在“肠道消化”。在6孔培养板的制备细胞单分子膜。紧接肠道消化期,每一个细胞培养生长中期被解除了。在pH7,37°C最小主要媒介细胞层被冲洗两次与。这是因为它被选为纪念中不添加铁和具有以下成分,一经制定,,总是发现含有免疫球蛋白铁小于80/L的该便函补充了10mmol/L的管道,1%抗生素/抗真菌溶液,氢化可的松(4毫克/升),胰岛素,硒和甲状腺素和表皮生长因子。一新鲜的1.0毫升等分在实验过程中涉及的细胞。阿消毒插入环,与透析膜装置,当时插入井,创造了两院制。然后,1.5毫升等分的肠道消化的吸管将上层室。该板块再覆盖上的摇摆和培养120分,每6分钟钟摇床振荡。当肠道消化终止,消化插入环被拆除。在底部室解决方案获准继续留在细胞单层,另有1毫升的纪念添加到每个培养板。细胞培养板返回孵化器内增加了22个小时之后,细胞收获进行分析。为了确定在肠道内消化腔底部铁的扩散量为,培养板与每个细胞的复制实验,均是使用无细胞和处理相同。在肠道的消化期,结束整个测量室底部收集总铁溶液量。Caco-2单层细胞的回收为了铁蛋白的分析,在肠消化24小时后回收单层细胞。为了回收更多的细胞,中间的细胞也要回收。并且细胞要用2毫升含有140mmol/L的氯化钠,5mmol/L的氯化钾,和10mmol管道的冲洗液漂洗两次,调整pH为7。每个被漂洗的单层细胞放置在2毫升去离子水中。将每个平板放置在固定加上与试验台上的声波定位仪相连接,在4℃冷藏室存放这些细胞被声振15分钟,然后从其表面收获细胞,在每个培养皿中注入2毫升量水,保存在-20°C实验设计实验被分成五组,将每一组中的六个样本和六个标准组进行对比消化。每两个平板为一个重复实验,因此可以运用相同复制方法从每个样本中复制细胞铁。复制的平均数就是复制率。几天实验的结果就是复制率。在实验的第一个系列,将浓度为0,5,10,20,50和100ímol/L的三氯化铁加入到10毫升的140mmol/L的NaCl,5mmol/L的氯化钾和10mmol/L的管道,用5mol/L的盐酸调整pH值为222 。每个解决方案当时受到的消化过程描述以前。在实验的第二个系列,一将1∪ímol三氯化铁与10mmol/L的植酸结合,调整铁:植酸的摩尔比为1:0,1:1,1:3,1:10,1:20和1:40。接着,在每一个摩尔比中添加10毫升的140mmol/L的NaCl,5mmol/L的氯化钾,和10mmol/L的管道,pH值设置为2。每个解决方案当时的消化过程受到前面所述。如将每个胃蛋白酶消化体积调整为15毫升以下的,在肠道消化期开始的铁浓度是67ímol/L。第三个系列的实验设计,比较植酸对血红素铁红蛋白与非血红素铁效应。每一个标准非血红素或血红素含有1ímol铁。体外消化准备有无植酸如上所述第四系列的实验除了单宁酸用植酸的其他地方具有与第二个实验完全相同。第五个系列的实验旨在Caco-2细胞中确定锌影响对铁的吸收,并确定是否暴露前锌改变Caco-2细胞铁摄取高的水平。对于这些实验,三氯化铁和ZnCl2相结合,在pH2,然后股票解决方案加入10毫升的达140mmol/L的NaCl,5mmol/L的氯化钾和10mmol/L的管在pH值2,收益率50ímol/L和铁浓度不变锌浓度为0,25,50ímol/L的每个消化。此外,在每个板块的6细胞单层3暴露于无血清最基本的媒体(Gibco公司。41500-067),其中包含50ímol/L的氯化锌48小时前,每个试验分析:样本的准备和酸的分析所有都用玻璃器皿处理,Caco-2细胞蛋白检测的样品已溶解在0.5mol/L的氢氧化钠,采用半微量生物蛋白检测试剂盒测定。第一阶段,两组用于检测Caco–2细胞铁蛋白的含量。10的样本声振的Caco-2细胞单层,在收获2毫升的水,被用于每个铁蛋白测量。试验研究已经确定,Caco-2细胞样本取样之前准确测定铁蛋白,离心没有必要。描述:数据的分析描述是GraphPad软件整合后以供使用。进行统计分析的方法根据莫图尔斯基(7)。此前分析,数据记录,转化为实现方相等。是由于每一个在我们的研究实验复制配对比较,反复进行了方差分析与措施在杜克的后测,以比较各种系列的各种手段实验。意味着被视为显着不同程度的P值小于或等于0.05。治疗组内差异是表示为均值(教统局局长)标准错误22 结果:图2中铁蛋白反映逐步添加三氯化铁的描述,结果显示在无食物或不含其它蛋白质成分时,铁的最大吸收范围在20—50ímol/L。图3中说明植酸是影响铁吸收的主要因素。浓度相等的Fe与植酸导致70%的铁吸收被抑制。植酸1:3的比例铁的吸收下降了79%,在铁与植酸的比例为1:10发生抑制铁最大吸收(85%)。在1:1和1:3铁的可溶性下降了,以增加铁与植酸的比率,但在铁:植酸比例比1:3更大,表明在高植酸水平更多的铁被溶解,但利用率低。图二变量是FeCl3消化的含量,最高的一组代表肠消化,最底层平板被分离的铁的含量。最低的一组代表Caco–2细胞铁蛋白反映铁的消化。变量代表意思。图4份文件的植酸对非血红素铁的吸收抑制效应类似图3中观察到以1:10植酸与铁的摩尔比。植酸对非血红素铁的吸收抑制百分比为88%。这植酸减弱对血红素铁吸收的影响观察到的只有31%的抑制。22 图5总结了单宁酸对铁吸收的影响。单宁酸生产的最大抑制(92%)的铁的吸收就存于一1:0.1的比例最低。越来越多的单宁酸总底部铁无明显影响。图6锌在铁吸收中的影响。在1:0.5和1:1的比例增加了氯化锌分别下降58%和82%铁质摄取。的同在25和50ímol/L水平的氯化锌预处理细胞培养48Ĥ没有显著影响铁质的吸收。在消化中锌的含量并不影响铁的吸收。讨论目前的研究清楚表明植酸,单宁酸,锌对Caco-2细胞铁的吸收的抑制作用,所有这些都被证明能抑制人类铁的吸收(8-11)。在一个体外消化digestion/Caco-2细胞模型是一个对人类铁的利用是有用的预测,它要在这个文件系统中的抑制剂和推动剂在观察人体试验中的作用。这是必须指出的抑制剂的使用比例在这铁类似的研究范围,在发现的食品和膳食条件。我们研究的主要目标是运用体外模型研究抑制铁吸收的这些化合物。这项研究验证该系统的应用的影响,并且这在进一步加强食品开发体系中提供有用的信息。22 这个模型系统是为了确定具体的铁:植酸摩尔比,确定在一个特定的结果水平的影响。例如,图3的结果表明这铁摩尔比例为1:10或更高植酸,结果对铁摄取最大的抑制作用。抑制小于在一些1:3和1:10之间最大植酸铁点酸比。这种类型的研究在人体执行由于成本高多组治疗将不符合成本效益的。人们应该注意到,这些比例可能只适用于研究的具体条件本作为增加食物或其他化合物有可能修改这些结果。血红素铁相对于非血红素铁植酸影响较小,(图4)。在这项研究中由于植酸与铁的比例1:10,研究结果支持意见,即血红素铁不容易被植酸抑制(12)。这是血红素铁是认为,作为一个完整的肠上皮吸收金属卟啉后水解酶从珠蛋白中释放的(13)。或许,正是这种卟啉环结构血红素铁的盾牌植酸从饮食以及其他促进剂在抑制剂。应该指出的是,血红素铁吸收,并不完全不受饮食成份影响。例如,已经证明肉类,以提高血红素铁吸收(12,14)。此外,血红素,血红素一个纯化一小部分,形式在中性pH值高的分子量聚合已被证明是非常不易吸收的(13,15)。除此之外,然而,已经被证明该珠蛋白有助于预防血红素聚集,从而增加吸收(15)图四植酸影响血红素铁和非血红素铁的利用,在无细胞存在培养皿底部在肠消化期结束后顶部平板用来测定铁的含量。肠消化开始24小时后。下图数字代表Caco–2细胞铁蛋白的形成物。无符号条形住差异显著。大量文献证明多芬化合物抑制铁的吸收。在诸多文献中证据表明多酚类化合物抑制铁的吸收(16,17)。在这种体外实验中,结果表明,单宁酸相对植酸或锌是一种更强有力的抑制铁的吸收抑制剂。结果表明:一个铁的摩尔比1:0.1的这些简单条件,单宁酸以产生最大的或接近最大抑制铁吸收。在较为复杂的膳食条件下,单宁酸的效能可能会有所不同。例如,布伦等。(18)准备小麦面粉加上从不设防白面包中。比较了越来越多的单宁酸的影响,观察与铁的吸收和人体的单宁酸的含量呈逆剂量反应关系。最大的铁在体内吸收的抑制为88%和发生达到或接近1:1铁单宁酸的摩尔比。布伦等。还指出,,没食子酸抑制铁的吸收,单宁酸(每摩尔没食子酰组)和绿原酸抑制铁的吸收相同程度或程度较轻。在测试餐时加入儿茶素。他们得出结论认为他们没有观察到抑制铁吸收。没食子酰组是,制约饮食中铁含量的主要因素铁吸收的抑制是可能由酚类化合物与铁结合,使铁不能被铁吸收利用。单宁酸结合铁具有较高的亲和力(19)。正如植酸,其他化合物或食品添加剂可能会改变的抑制作用。很少人知道铁多酚影响铁的利用率。;但是,我们相信这个模型系统代表的对这一类的化合物铁的供应办法有效地调查,。使用这种测量,这将需要一个系统的办法识别和分离的耦合化合物的。鉴于许多食品,设防高22 水平食物中补充的铁和锌的相互作用和代表在营养方面的关键问题。铁已被证明能够抑制肠道锌吸收(9-11)。这种效应已初步被证实在哪情况里发生铁消耗。鉴于许多食品,高设防水平食物中的铁和锌的相互作用和补充代表在营养方面的关键问题。铁已被证明能够抑制肠道锌吸收(9-11)。这种效应已初步铁被证实发生在哪里铁消耗情况作为一餐,而不是成为一个(20)而成立的补充。一最近的研究Donangelo等。(21)表明,锌补充剂也可能抑制饮食中的铁的吸收。在这项11健康非贫血妇女低铁储备检查研究,补充锌对铁代谢的影响。研究对象补充锌的摄入在晚上晚饭后2小时。结果表明,锌补充锌的地位提高了,但生产指数铁代谢的变化提示细胞缺铁并进一步枯竭一个可能的原因。存在在肠腔中的补充锌,铁的损失可能是由于铁的吸收不足的。在目前的研究,我们测试了类似的效果,并指出,锌抑制铁的吸收。我们的研究条件,将是人体摄取铁和锌最类似的情况下同时作为补充。预处理的细胞50ímol/L的锌为48小时不影响铁的吸收。显然,结果表明,应该做更多的工作进行调查在各类食品基质锌和铁的相互作用。图3。摘要在不同摩尔比含量的三氯化铁加植酸测量变量(1ímol/15毫升,也就是说,67ímol/L)。在2小时肠道消化期,顶端面板代表了较低的面板底部透析室铁的加入一定量的。Caco-2细胞铁蛋白的形成代表回收铁。价值观代表平均±标准差,n)的5。无信律师价值观在常见的有显着差异(p<0.05)。图4:植酸的影响层(PHY)的非血红素铁(Fe)和血红素(血红蛋白;血红蛋白)铁可用性。肠道消化期顶部面板代表了铁含量测定在底部室无细胞在结束目前的。底部的数字代表Caco-2细胞铁蛋白的肠道消化期后24小时开始形成。酒吧价值观与普通信件没有显着差异(p>;0.05)。价值观是指+扫描电镜;n)的5图5:非血红素铁供应单宁酸。顶部面板代表室的底部,没有铁的量测细胞在肠道消化期结束时在座。底部数字代表Caco-2细胞铁蛋白的形成24小时后开始测量在肠道消化期。在共同的价值观不信酒吧有显着差异(p>0.05)。价值观是指+扫描电镜;n)的4-6。在世界各相当多的研究工作都是针对提高营养食品质量和效益的补充节目地。这些努力的大部分是旨在改善儿童和生育年龄妇女铁地位的。本研究需要一个范围广泛的食品和膳食条件下的铁的研究可用性和养分的相互作用。在体外模型直接研究能准确预测在影响人类的膳食条件似乎是唯一符合成本效益的方法,提高食品质量。该模型研究结果和有关文献全面表明,这种系统可用于这一领域研究。这个模型如何定义与可以预测人铁的吸收,需要同时测量样品来自同样的食物,或在体外和人类膳食审判。目前,有研究的专家进行体外文本预测比较短期(餐单)和较长期的研究(多餐或饮食疗法)与涉及人类的研究结果中铁的吸收科目。22 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