污水微生物指标检查法

邯郸矿业集团总医院污水排放微生物指标检测方法污水总大肠菌群的检验方法一、采样方法　　用采水器或其他灭菌容器采取污水样1000毫升，放入灭菌瓶内，如果是经加氯处理的污水，需加1.5%硫代硫酸钠5毫升中和余氯。二、检验方法　　总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌在37℃恒温箱内，培养24小时，能使乳糖发酵产酸产气。总大肠菌群数系指每升污水中，所含的总大肠菌群的数目。　　（一）初发酵试验：以无菌操作将各盛有3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液5毫升的5支发酵管内，各接种污水样10毫升，将各盛有单料乳糖蛋白胨培养液约10毫升5支的发酵管内，各接种污水样1毫升，再将各盛有单料乳糖蛋白脏培养液约10毫升的5支发酵管内，各接种1∶10稀释的污水样1毫升（相当于原污水样0.1毫升）。将此15支管已接种的发酵管置于37℃恒温箱内，培养24小时。　　（二）平板分离：经培养24小时后，将产酸产气及只产酸不产气的发酵管，分别接种于伊红美兰培养基或品红亚硫酸钠培养基上，置37℃恒温箱培养18～24小时，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分，进行涂片、革兰氏染色、镜检。　　1伊红美兰培养基上的菌落色泽：　　（1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落；　　（2）紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；　　（3）淡紫红色、中心色较深的菌落。　　2品红亚硫酸钠培养基上的菌落色泽：　　（1）紫红色，具有金属光泽的菌落；　　（2）深红色，不带或略带金属光泽的菌落；　　（3）淡红色，中心色较深的菌落。　　（三）复发酵试验：涂片、镜检的菌落，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取上述典型菌落1～3个接种于一支单料乳糖发酵管内，然后置于37℃恒温箱内，培养24小时，产酸产气者（包括小量产气）即证实有大肠菌群存在。　　根据证实有大肠菌群存在的阳性管数，查对总大肠菌群近似数（MpN）检索表（附表1.1）即是每升污水中的大肠菌群数。此MPN表中所列数值系指100毫升水样中的细菌数，因此需将表中的数值再乘10、为每1000毫升水中的细菌数。举例：某一污水样接种10毫升的5支管中有5管为阳性；接种1毫升的5支管中有2管为阳性；接种1∶10稀释水样1毫升（即原污水样0.1毫升）的5支管皆为阴性，即结果为5、2、0，查附表1.1得知100毫升污水中总大肠菌群数为49个，即1000毫升污水中总大肠菌群数为49×10＝490个。8 邯郸矿业集团总医院污水排放微生物指标检测方法　　总大肠菌群近似数（MPN）检索表附表接种量(毫升)每100毫升水样中总大肠菌群近似数接种量(毫升)每100毫升水样中总大肠菌群近似数1010.11010.100000000000001234502457900000044444401234589111315170000001111110123452467911000000555555012345911131517190000002222220123454679111311111100000001234524681012000000333333012345679111315111111111111012345468101214（总接种量55.5毫升，其中5份10毫升水样；5份1毫升水样；5份0.1毫升水样）　　8 邯郸矿业集团总医院污水排放微生物指标检测方法续表1接种量(毫升)每100毫升水样中总大肠菌群近似数接种量(毫升)每100毫升水样中总大肠菌群近似数1010.11010.1111111222222012345681012151722222200000001234557912141611111133333301234581012151719222222111111012345791214171911111144444401234511131517192222222222222201234591214171922111111555555012345131517192224222222333333012345121217202225（总接种量55.5毫升，其中5份10毫升水样；5份1毫升水样；5份0.1毫升水样）　　续表28 邯郸矿业集团总医院污水排放微生物指标检测方法接种量(毫升)每100毫升水样中总大肠菌群近似数接种量(毫升)每100毫升水样中总大肠菌群近似数1010.11010.122222244444401234515172023252833333322222201234514172024273122222255555501234517202326293233333333333301234517212428323633333300000001234581113162023333333444444012345212428323640333333111111012345111417202327333333555555012345252932374145（总接种量55.5毫升，其中5份10毫升水样；5份1毫升水样；5份0.1毫升水样）　续表38 邯郸矿业集团总医院污水排放微生物指标检测方法接种量(毫升)每100毫升水样中总大肠菌群近似数接种量(毫升)每100毫升水样中总大肠菌群近似数1010.11010.144444400000001234513172125303644444444444401234534404754626944444411111101234517212631364244444455555501234541485664728144444422222201234522263238445055555500000001234523314358769544444433333301234527333945525955555511111101234533466384110130（总接种量55.5毫升，其中5份10毫升水样；5份1毫升水样；5份0.1毫升水样）　　续表4接种量(毫升)每100接种量(毫升)每1008 邯郸矿业集团总医院污水排放微生物指标检测方法毫升水样中总大肠菌群近似数毫升水样中总大肠菌群近似数1010.11010.1555555222222012345497094120150180555555444444012345130170220280350430555555333333012345791101401802102505555555555550123452403505409201600>1600（总接种量55.5毫升，其中5份10毫升水样；5份1毫升水样；5份0.1毫升水样）污水沙门氏菌属和志贺氏菌属的检验方法一、样品处理　　水样500毫升，加入灭菌的10%无水碳酸钠溶液2毫升，混合后，再加入灭菌的10%硫酸铁溶液1.75毫升，混合均匀。静置1小时，倾去上清液（沉淀物约为408 邯郸矿业集团总医院污水排放微生物指标检测方法毫升左右）。进行沙门氏菌属和志贺氏菌属培养。　　二、增菌培养　　1沙门氏菌属：吸取样品处理后的沉淀物20毫升，加于20毫升双料亚硒酸盐（SF）增菌液内，也可加于亚硒酸盐甘露醇（SFM）或氯化镁孔雀绿（MM）增菌液内。置于37℃或41℃恒温箱；培养24小时。　　2志贺氏菌属：吸取样品处理后的沉淀物20毫升，加于20毫升双料革兰氏阴性（GN）增菌液内，置于37℃恒温箱，培养6小时。　　三、平板分离　　1沙门氏菌属：取上述经培养的沙门氏菌用增菌培养液，接种沙门氏菌属——志贺氏菌属（SS）平板或海克托因（Hekto－en简称HE）平板，置于37℃恒温箱培养24小时。也可接种亚硫酸铋（BS）平板，置于37℃恒温箱，培养48小时。　　2志贺氏菌属：取上述经培养的志贺氏菌用增菌培养液，接种SS平板或HE平板，置于37℃恒温箱，培养24小时。　　四、挑选菌落　　1沙门氏菌属：挑取在SS平板上，呈无色透明或中间有黑心，直径1～2毫米的菌落；挑取在HE平板上，呈蓝绿色，有或无黑心，直径1～2毫米的菌落；挑取在BS平板上，呈黑色，培养基周围具有金属光泽的菌落。　　2志贺氏菌属：挑取在SS平板上，呈无色透明，直径1～1.5毫米的菌落，挑取在HE平板上，呈绿色的菌落。　　3每个平板最少挑取5个以上可疑肠道病原菌菌落，转种三糖铁或其他鉴别培养基中，置于37℃恒温箱；培养18～24小时。　　五、生化试验及血清学检验　　1沙门氏菌属：在三糖铁培养基中，如不发酵乳糖，葡萄糖产酸产气或只产酸不产气，一般产生硫化氢。有动力者，先与沙门氏菌A～F群O多价血清作玻璃片凝集，凡与多价O血清凝集者，再与O因子血清凝集，以确定其所属群别，然后用H因子血清，确定血清型。双相菌　　应证实两相的H抗原，有Vi抗原的菌型（伤寒和丙型副伤寒沙门氏菌）应用Vi因子血清检查。　　化试验：应进行葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、蔗糖、靛基质、硫化氢、动力、尿素试验。沙门氏菌属中除伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌产气外，通常发酵葡萄糖、产气、均发酵甘露醇和麦芽糖（但猪伤寒沙门氏菌、雏沙门氏菌不发酵麦芽糖），不分解乳糖、蔗糖，尿素酶和靛基质为阴性，通常产生硫代氢。除鸡、雏沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的O型菌株无动力外，通常均有动力。如遇多价O血清不凝集而一般生化反应符合上述情况时，可加做侧金盏花醇、水杨素和氰化钾试验，沙门氏菌均为阴性。　　28 邯郸矿业集团总医院污水排放微生物指标检测方法志贺氏菌属：在三糖铁培养基上，葡萄糖产酸不产气，无动力，不产生硫化氢，上层斜面乳糖不分解。　　生化试验：应进行葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖，蔗糖、靛基质、硫化氢、动力、尿素试验。志贺氏菌属能分解葡萄糖，但不产气（福氏志贺氏菌6型有时产生少量气体），一般不能分解乳糖及蔗糖，宋内氏志贺氏菌对乳糖及蔗糖迟缓发酵产酸。志贺氏菌属均不产生硫化氢，不分解尿素，无动力。对甘露醇、麦芽糖的发酵及靛基质的产生，则因菌株不同而异。　　如遇多价血清玻璃片凝集试验为阴性，而生化反应符合上述情况时，可加做肌醇、水杨素、V—P、枸橼酸盐、氰化钾等试验。志贺氏菌属均为阴性反应。　　血清学检查：志贺氏菌属分为4个群，先与多价血清作玻璃片凝集试验，如为阳性，再分别与A、B、C、D群血清凝集，并进一步与分型血清做玻璃片凝集，最后确定其血清型。8