生物固氮与人工模拟生物固氮

生物固氮与人工模拟固氮摘要:生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一,它在生产实际中发挥着重要作用:为植物特别是粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污染和疾病、防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展。本文旨在了解现在国际生物固氮和人工模拟生物固氮的现状，思考如何使用生物技术（特别是蛋白质工程）在固氮领域。关键词:生物固氮人工模拟固氮固氮酶化学模拟引言：空气中约80%的氮气不能被植物直接利用,只有固氮微生物具有将氮气转化成氨的能力,人们称为生物固氮。据联合国粮农组织(FAO)1995年粗略估计,全球每年由生物固定的氮量已近2×106t(相当于4×108t尿素),约占全球植物需氮量的3/4。所以,生物固氮是地球上最大规模的天然氮肥工厂。但为了满足需求还要新建很多氮肥厂,投资上千亿元.一方面,适量使用化学氮肥可使粮食高产;另一方面,生产化学氮肥要大量消耗能源,加重大气污染和温室效应.大量施用化肥,不仅提高农业生产成本,而且导致水土污染,影响健康和破坏生态平衡.对于提高农业产量,降低化肥用量和农业生产成本,减少水土污染和疾病,治理占我国国土面积约27%的荒漠化地区,发展可持续农业,生物固氮将起重要作用。而生物固氮中用到的固氮酶是一种重要蛋白质，联想到课上学 习的生物工程中蛋白质工程，我想到用蛋白质工程来制作新的更高效率的固氮酶来提高人工模拟固氮的产量，从而节省投资成本和保护环境。1生物固氮1．1生物固氮概念：生物固氮是指固氮微生物将大气中的氮气还原成氨的过程。固氮生物都属于个体微小的原核生物，所以，固氮生物又叫做固氮微生物。根据固氮微生物的固氮特点以及与植物的关系，可以将它们分为自生固氮微生物、共生固氮微生物和联合固氮微生物三类。1.2生物固氮的过程生物固氮是固氮微生物特有的一种生理功能，这种功能是在固氮酶的催化作用下进行的。固氮酶是一种能够将分子氮还原成氨的酶。固氮酶是由两种蛋白质组成的：一种含有铁，叫做铁蛋白，另一种含有铁和钼，叫做钼铁蛋白。只有铁蛋白和钼铁蛋白同时存在，固氮酶才具有固氮的作用。[1]1．3生物固氮的研究现状当前,国内外生物固氮研究已进入一个新阶段,其特点是多学科交叉,将基础研究和应用前景相结合,开拓了思路.当前生物固氮研究正在分子和原子水平上开展,如:固氮基因表达的铵阻遏和氧敏感机制;共生结瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控;根瘤菌结瘤因子的结构和生物合成;根瘤菌及其宿主植物的基因组学、 转录组学和蛋白质组学;固氮酶的结构和功能及其化学模拟;固氮效率的提高及其在农业和环境保护中的应用等.这些研究要求生物学、农学、化学和物理学等学科的交叉和结合,引入新概念和新技术,综合进行。[2]1．4目前自然界存在的固氮酶自然界中存在的固氮酶是一种能够将分子氮还原成氨的酶。固氮酶是由两种蛋白质组成的：一种含有铁，叫做铁蛋白，另一种含铁和钼mo2+，称为钼铁蛋白。这种酶在固氮的过程中每个电子的传递需要消耗2~3个ATP，而且一般固氮生物在固氮的同时也会产生氢气，因此固氮的总反应式可写为：N2+8H++8e---------->2NH3+H21.5我国生物固氮研究成果的国际认可和曾经面临的困境“生物固氮”成为科学定义并开始大力研究已有114年的历史.我国自1937年开始生物固氮研究,已有65年历史.20世纪70年代生物固氮研究在生物化学和分子遗传学等方面取得突破后,我国也取得了一系列重要成果,在国际上占有一定的地位,在某些方面还具有重要影响.因此,国际生物固氮研究委员会主席W.Newton曾多次建议在中国召开国际生物固氮研究大会,经研究决定2003年在北京召开第14届国际生物固氮大会.我国生物固氮研究的道路曲曲折折, 曾经有两种错误认识:一是受到假冒伪劣生物固氮肥料的宣传的干扰,认为生物固氮问题已经解决;二是对国际和国内生物固氮研究的突破性进展了解不够,认为难度大,进展甚微,国内经多年研究也未出成果.两者的结果使我国的生物固氮研究面临严重困境.为防止困境再现,经我国有关决策者和研究人员的共同努力,恢复了固氮研究应有的地位.这就为巩固研究成果,继续发展,不失时机地迎接生物固氮的重大突破的新时代的到来,并把生物固氮研究中与生命科学其他学科相关的重大科学问题提高到一个新水平,使其进一步为我国农业可持续发展做出重要贡献.2人工固氮2.1人工固氮概述及近况工业上通常用H2和N2在催化剂、高温、高压下合成氨（3H2+N2=催化剂，高温=2NH3）近况：两位希腊化学家，位于Thessaloniki的阿里斯多德大学的GeorgeMarnellos和MichaelStoukides发明了一种合成氨的新方法(Science，2Oct．1998，P98)。在常压下，令氢与用氦稀释的氮分别通入一加热到570℃的以锶-铈-钇-钙钛矿多孔陶瓷(SCY)为固体电解质的电解池中，用覆盖在固体电解质内外表面的多孔钯多晶薄 膜的催化，转化为氨，转化率达到78%；对比：几近一个世纪的哈伯法合成氨工艺通常转化率为10至15%！他们用在线气相色谱检测进出电解池的气体，用HCl吸收氨引起的pH变化估算氨的产率，证实提高氮的分压对提高转化率无效；升高电流和温度虽提高质子在SCY中的传递速度却因SCY导电率受温度限制，升温反而加速氨的分解。2.2生物工程在人工固氮中的作用现在的人工固氮大多用具有生物固氮调控机理的植物与微生物，而这些植物（如豆科植物）和微生物（如根瘤菌）可以用基因工程来进行加工和生产。生物工程中的其他技术比如细胞工程在这个环节上也可以应用，也可以获得更多的产量。国际上已经对固氮酶高分辨率的空间结构进行了研究,阐明了其活性中心的原子簇FeMoco及其周围蛋白分子的三维结构[38,39].Schmid等人[3]对棕色固氮菌缺失FeMoco的突变种nifB-Av1的钼铁蛋白组分做了晶体衍射结构分析,发现4个亚单位中的1个构象发生了较大变化,存在一个带正电的漏斗状(funnel)结构,它足够容纳带负电的FeMoco的插入,成为具有固氮功能的钼铁蛋白组分.与此同时,化学模拟固氮酶在温和条件下合成氨有了很大进展.在这个领域里我国也做了大量非常出色的工作:固氮酶催化HD的形成绝对依赖于氮[4];在固氮酶催化还原N2的放氢机制中,率先提出了双位点放H2模式,对了解固氮酶催化机制有所发展[5].美国1992年用X光衍射确定固氮酶活性中心原子簇是由MoS3Fe和FeS3Fe3两个缺口的 立方烷型簇合物组成[6],通过3个非蛋白配体S桥联而成为一个笼(其顶端分别是Fe和Mo).其实在此之前,我国就已经合成了这两个簇合物[7];根据配位催化原理和化学探针思路,提出活性中心原子簇笼应是活口的,N2还原成氨和质子还原成H2都是在笼内进行,提出用于还原底物有两条质子通道的设想。这些进展对指导合成高效催化剂,实现在温和条件下固氮有重要意义。2.2共生固氮中包括蛋白质组学在内的功能基因组学研究共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究包括根瘤菌和宿主植物两个方面.功能基因组学研究的前提是对目的生物的基因组进行全序列分析.目前国际上已经对苜蓿根瘤菌基因组进行了全序列分析,接着是大豆根瘤菌和百脉根根瘤菌(Rhizobiumloti)基因组.在宿主植物方面已经启动了对苜蓿MedicagosativaLin)、大豆(GlycinemaxLin)和百脉根(Lotuscorniculatu)基因组序列的分析.这些研究成果将为固氮功能基因组和蛋白质组学研究奠定基础和建立技术平台.目前,固氮功能基因组和蛋白质组学已经陆续有所报道.固氮资源生物多样性研究表明,不同根瘤菌可与同一豆科植物相互作用结瘤固氮,但它们之间的结瘤固氮效率却大不相同.同样,同一根瘤菌可与不同属的豆科植物结瘤固氮[8].这一结果为开展共生固氮功能基因组学和蛋白质组学研究奠定了基础.可以充分利用公布的苜蓿根瘤菌基因组序列,通过RNA和蛋白质差异显示法和微阵列法,对不同苜蓿根瘤菌基因组及其突变株在共生条件下进行功能比较, 对不同根瘤菌在同一豆科植物结瘤的不同根瘤素基因表达进行比较,将可大大推进共生结瘤固氮中微生物与植物相互作用机理的研究.在此基础上,还可寻找非豆科植物,特别是禾本科植物中是否有以及有多少类似于豆科植物的根瘤素存在,从而最终为非豆科植物的共生固氮和自主固氮提供策略和技术路线.无疑,共生固氮功能基因组和蛋白质组学研究将具有更为重大的科学意义和潜在的实际意义.参考文献[1]卢嘉锡,蔡启瑞,万惠霖,等.生物固氮全球的挑战和未来的需要[J].辽宁科技参考,2001(4):26[2]沈世华荆玉祥．中国生物固氮研究现状和展望<<科学通报>>2003年第48卷第6期[3]林敏,尤崇杓,刘永正,等.重组耐铵固氮菌株的田间长期定点释放试验.生物技术学报,1995,1:28~33[4]李永兴,李久蒂,卢林刚,等.玉米联合固氮工程菌EnterobactergergivuaeE7在田间的接种效应.中国农业科学,2000,33:72~77[5]王水平,朱家璧,俞冠翘,等.苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)nifA基因的异源表达及其产物的氧敏感性.中国科学,B 辑,1990,(3):261~266[6]何路红,阎大来,马旅雁.肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮基因表达的铵调节中的作用.生物工程学报,1995,11:385~38825马旅雁,吴奥,赵银锁.巴西固氮螺菌Yu62dragTG基因及其下游区域的定位诱变.生物工程技术学报,1999,15:281~287[7]吴新涛,卢嘉锡.固氮酶活性中心网兜模型的回顾和前瞻.科学通报,1995,40(7):577~581[8]PanterS,ThomsonR,deBruxellesG,etal.Identificationwithproteomicsofnovelproteinsassociatedwiththeperibacteroidmembraneofsoybeanrootnodules.MolecularPlant-MicrobeInteractions,2000,13:325~333