微生物培养基的凝固剂

培养基凝固剂及触变性培养基摘要介绍常用培养基凝固剂琼脂、卡拉胶和黄原胶的凝胶性质。将这三种凝胶配伍使用可配制出具有触变性的培养基，用于特殊的微生物检测。关键词培养基凝固剂触变性微生物培养基是专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保藏用的混合营养物制品，常见形态有液态、流态、半固态和固态。液体培养基常用于大规模生产和增菌培养；流体培养基常用于霉菌和厌氧菌的检查；半固体培养基常用于菌种传代和保藏，以及贮运标本；固体培养基常用于微生物的分离纯化，抗菌药物的效价试验，菌和疫苗的制造以及菌种保藏。这几种培养基的差别主要取决于培养基中凝固剂种类和加量的差［1］。培养基凝固剂一般并不是微生物的营养成分，只起固化或粘合的作用［2］，形成凝胶。常见的凝固剂有琼脂、卡拉胶、黄原胶、阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶和无机硅胶等。凝胶是胶体质点或高聚物分子相互交联形成的空间网状结构，是介于固体与液体之间的一种特殊的物质形态［3］。凝胶化是指缩聚反应进行到一定程度，反应体系的粘度突然增大，并且出现具有弹性的凝胶的现象。此时，体系包含两部分：一部分是凝胶，不溶于一切溶剂；另一部分是溶胶，其分子量较小，被笼罩在凝胶的网络结构中［4］。由于微生物快速检测的需要，传统的固体及液体培养基已经不能满足现代微生物检测的需求。如检测油类物质中的微生物，培养基在接种时应为粘度低的溶胶，而在静止培养时，又需恢复为高粘凝胶，使菌落不易移动，便于观察与计数，这就需要培养基具有触变性。国外已商品化生产的有MicrobMonitor［2］培养基成品。使用前不需进行培养基的制备和加热就可直接应用，但国内还没有类似产品。 1琼脂琼脂是一种由琼脂糖和琼胶质组成的长链多糖复合体，是从石花菜、江篱、紫菜等红藻类植物中提取而制成的。在液体培养基中加l0～20g／L的琼脂，加热融化凝固后可得固体培养基，加5g／L的琼脂可得半固体培养基［2］。琼脂溶于75℃以上的热水和甲酰胺，微溶于乙醇胺，不溶于冷水，但能吸水膨胀。琼脂溶解后，胶液具有一定的粘性，5％～10％的琼脂溶胶具有高粘度。在45℃、pH4．5～9．0时，胶液的粘度相对稳定，在pH6．0～8．0范围内，胶液粘度与藻龄、离子强度关系不大，但一旦凝胶形成，在温度不变的条件下，粘度随时间而增大。琼脂溶解后，胶液在42℃以下会凝固。文献［5］报道由不同种类的原料所制取的琼脂具有不同的凝固温度，而由相同原料制取的琼脂，其凝固温度基本一致。琼脂的凝胶强度与其浓度和生产方法有关，韧性与其粘度和原料的种类有关琼脂的融化温度与凝固温度之差即滞后度比一般凝胶大，为40—60℃。pH接近中性时，琼脂能与大部分多糖胶配伍，与蛋白质混合不发生絮凝，也不明显沉淀(组胺树胶除外)。琼脂的流变性变化是琼脂凝胶化过程的一个重要特征：①高温时，流变行为与稀溶液中聚合物的流变行为相似；②当温度低至凝固点以下时，流变行为与交联聚合物的流变行为相似；③在溶胶与凝胶的变化过程中，流变性更为复杂；④琼脂的流变性还受其浓度、分子量以及其它物质(如甘油等)的影响。2卡拉胶卡拉胶是存在于杉海苦科、苏里尔藻科、叶顶藻科和沙藻科的某些红海藻中的不溶性胶。它溶于60℃以上的热水，形成粘性透明或轻微乳白色的易流动溶液，45℃以下凝固［7］，2．0％一2．5％的凝胶强度与琼脂1．5％一2．0％浓度时的凝胶强度基本一致［8］ ，但不溶于有机溶剂。卡拉胶大分子没有分支结构，也不具有阴离子特性，可以形成高粘度溶液。(1)徐志丽和吴晖［9］研究发现卡拉胶的粘度：①随分子量的增大而显著增大；②随浓度增大呈指数规律增加；③随温度升高呈指数规律下降；④在接近中性时基本稳定且最大。(2)卡拉胶溶液的粘度：①随恒温时间而降低；②100℃时，下降有急有缓；③随着转速增大，溶液粘度缓慢下降，具有剪切稀化的特征；④随搅拌时间先缓慢上升，80min后又下降［10］(3)卡拉胶的凝胶强度：①在一定范围内与浓度呈正线性关系；②温度上升，凝胶强度下降，但温度升降过程的变化曲线不同；③在凝胶开始形成的短时间内，凝胶强度随时间迅速增大，然后相对稳定，十余小时后又开始下降；④pH<5．0时，凝胶强度随pH的增大而增强，pH5．0—8．5时趋于平衡，pH8．0—9．5时又下降，而当pH>9．5时又回升。(4)卡拉胶形成凝胶所需浓度低，透明度高，但存在凝胶脆性大、弹性小、易脱液收缩等问题。这些问题可通过与其它高聚物配伍的方法来解决，国内外学者对此做了大量研究。黄来发等［11］研究发现槐豆胶和卡拉胶的相互作用使凝胶较强韧、较柔软，且不易出现脱液收缩的现象。3黄原胶黄原胶是由植物的细菌性病害甘蓝黑腐病产生，由β—D一葡萄糖、β—D一甘露糖和β—D一葡萄糖醛酸三种单糖组成的。它遇水分散、乳化变成稳定的亲水性粘稠胶体，胶液呈中性。黄原胶溶液是典型的假塑性流体，添加海藻酸钠可改善其假塑性程度［12］。Pettitt［13］的综述是黄原胶应用的理论基础。(1)黄原胶溶液的粘度与温度和浓度有关：① 室温下低浓度黄原胶溶液的粘度就很高；②室温下质量分数为0．5％溶液的粘度约为0．4Pa·s；③质量分数为1％溶液的粘度约为1Pa·s；④质量分数为2％溶液的粘度约为3—4Pa·s；⑤在90℃以下，温度变化对黄原胶溶液的粘度影响很小；⑥在90℃以上，溶液中的螺旋网格结构被破坏，但这个过程是热可逆的。(2)粘度变化与溶液pH值和其他添加剂的存在也有关：①pH值较高时，二价金属离子会引起黄原胶胶凝；②多价盐类也会引起胶凝，高pH值时尤为明显；③三价金属离子在中性，甚至酸性条件下都会引起黄原胶胶凝；④添加鳌合剂可防止胶凝作用。(3)黄原胶对多种植物胶具有特异性的凝集反应，凝集反应研究是从半乳甘露聚糖中的洋槐豆胶和瓜尔胶开始的［14］，进一步研究发现：①黄原胶与糊精、瓜儿豆胶和刺槐豆胶混合时表现出粘度增加的协同效应；②黄原胶还可以与大多数合成的水溶性聚合物(除高浓度的丙烯酸聚合物外)配伍；③阿拉伯胶在中至高浓度范围内可与黄原胶生成络合物；④建议黄原胶不要与纤维素衍生物配伍。4触变性培养基的制备触变性流体的流变行为与观测时间有关：①维持恒定的剪切速率所需的剪切应力随时间而减小［15］，因为在外剪切力的作用下，体系的粘度随时间下降；②当剪切作用停止后，粘度随时间的推移而增高，大多数经过一定的时间，可以恢复到初始粘度值；③触变性流体流动曲线的上行曲线与下行曲线不重叠，两条曲线之间形成了一个封闭的梭型触变环。前面已介绍了一些常见凝固剂的凝胶性质和流变性质。琼脂、卡拉胶和黄原胶都可形成高粘度溶胶：①琼脂形成凝胶后透明度高、弹性好、保水性好、无毒且不被微生物液化，但成本较高；②卡拉胶具有假塑性，透明度优于琼脂，原料来源广泛、成本低，但弹性不及琼脂好，较脆，凝固点高，滞后度小；③ 黄原胶也具有假塑性，对于热解和化学、物理、生物的降解均具有强对抗作用，但其溶液是非触变性的流体。所以，使用单一的凝固剂并不能得到较理想的触变性培养基，需要将多种凝胶配伍使用。将卡拉胶、黄原胶和琼脂这三种凝胶联合使用作为培养基支持物，试验表明：(1)当三种凝胶浓度分别为卡拉胶l3g／L、黄原胶2g／L和琼脂2．5g／L时，制取的培养基在振荡时呈流动性较好的溶胶状，保持静止5～30s后又可重新稠化，符合触变性的特性。且培养基具有以下性质：①澄清，透明度较高，颜色较浅，有利于观察；②水相物质可溶解，油相物质乳化并溶解；③在恒温箱中培养，可长出离散的菌落；④泌水性不明显；⑤不易被微生物降解；⑥能承受高温灭菌。培养基的这些性质使其特别适用于检测油类物质中的微生物。(2)在适当范围内等比例增大或减小三种凝胶的浓度可改变胶液的流动性。增大黄原胶的相对浓度，胶液的粘度也会相应增大。当黄原胶浓度达到4g／L时，胶液的流动性就变得很差。(3)在配制过程中，应注意使这三种凝胶充分溶解。若未完全溶解，则配成的培养基会有颗粒悬浮物。为使凝胶溶解效果较好，可采取以下措施：①所用的凝胶应颗粒细小而均匀，若因放置时间过久而结块，可用研钵磨细后再使用；②可先将凝胶称量好后用冷水浸泡数小时，再加热溶解；③溶解三种凝胶时，最好加热使胶液沸腾，确保凝胶完全溶解(4)琼脂可使培养基成胨状，为了不让培养基在灭菌后的冷却过程中结成一整块，在冷却的同时用磁搅拌子加以搅拌，则能形成较细腻的假塑性流体。搅拌时，应受力均匀，否则培养基不均匀。(5)注意在冷却搅拌过程中保证无菌环境，以免染菌。5结语 随着科学技术的发展，相信不久的将来，人们对微生物培养基凝固剂的各种性质以及配伍作用的机理的认识将会越来越透彻，从而使现有的培养基功能更加完善，并配制出更多具有特殊功能的培养基，使培养基凝固剂得到更好应用。