发育生物学实验讲义

实验讲义（实验报告只要求写前面两个）课程名称：发育生物学课程性质：专业限选课课程类型：限选课专业课专业：生物技术、生物科学学时：3224生物科学与工程学院细胞遗传学实验室12 目录实验一小鼠的饲养与常规实验操作4实验二小鼠的受精与繁殖6实验三小鼠的胚胎发育与胚胎移植1112 实验一小鼠的饲养与常规实验操作一、实验目的与要求：掌握小鼠饲养与一些常规实验的基本操作方法二、实验原理小鼠饲养是保证动物实验的前提。只有充分了解小鼠的生物学特性、生活习性和生理要求才能获得符合实验要求的小鼠。三、实验用品（一）、仪器、用具：饲养用具、注射用具等。（二）、材料：小鼠（三）、试剂：生理盐水四、实验内容与方法：（一）、饲养和管理采用专用鼠笼进行饲养，鼠笼中应放置木屑，按照实验和管理的需要选择垫料应除满足四无（无毒、无细菌和化学污染、无尘埃、无味）和四不能（不能促进细菌繁殖、不能着色、不致伤、动物行为不受影响）外，还应满足能消毒、保证供给、便宜等特点。小鼠的营养需要受遗传背景、疾病状况、妊娠及环境的影响。成年小鼠每天饮水6-7ML，而减少饮水会降低采食量。（二）、体温与水的调节按每克体重计算，小鼠的体重面积相对较大。因而，在环境温度变化时，小鼠在体温以及生理学上表现出较大的变化。小鼠不能耐受夜间的寒冷。由于小鼠的蒸发表面积与整个身体相比所占的比例大，因此，对减少饮水比大多数哺乳动物更为敏感。小鼠水分代谢的生物学半衰期（1.1天）比大的哺乳动物更为迅速。呼出的气体在鼻腔内冷却以及尿液的高效浓缩，都有助于水分的保持。水分的保持能使热量稳定。如果小鼠依靠身体水分的蒸发以防止体温升高，就可能发生脱水导致休克。小数没有汗腺，而且它的唾液分泌能力也很有限。小鼠能变化体温，以部分地代偿环境温度的改变。例如，当环境温度从20度上升到35度时，小鼠体温能从33.8度上升到37.2度。关在笼子里的小鼠不耐热，在周围温度达到37度时就开始死亡。小鼠的温度适中区随品系及适应性而异，但大约在29.6度—30.5度之间。但研究表明，小鼠在21度—25度的环境温度区内生长较快，窝仔数较多，并且比在适宜温度下饲养的小鼠更有活力。（三）、腹腔注射小鼠的抓取腹腔注射[腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下12 五、作业练习腹腔注射。12 实验二小鼠的受精与繁殖一、实验目的与要求：掌握小鼠从受精到繁殖的一系列过程二、实验原理小鼠是多次发情的动物，每4-5天出现一个发情周期。在前情期和发情期排卵时阴道内的活动上皮发育到顶点。上皮的退化性变化发生在第三个阶段，随后间情期是一个静止期，或者细胞生长缓慢，可以用阴道上皮的变化判断发情周期，这常用于测定雌鼠对于交配和受精最适宜的接受力。三、实验用品（一）、仪器、用具：显微镜、载玻片、电子称、圆头滴管、小烧瓶（二）、材料：雌、雄小鼠（三）、试剂：生理盐水四、实验内容与方法：（一）小鼠性周期的判定取达到性成熟的雌性小鼠，每日上午7-8时开始检查。用左手拇指与食指将小鼠两耳及第3、4指将背部皮肤握住、小指按住尾部，使尾部向上。用圆头滴管吸少许生理盐水滴入阴道口，用左手指按压小鼠腰部，反复冲洗2遍后将生理盐水滴于载玻片上进行镜检。见下图阴道涂片变化表。12 （二）受精与阴栓的确认小鼠交配后4-5分钟，形成一种白色浆液性物质堵塞在阴道至子宫颈的腔内，称阴栓，它是由雄性小鼠精囊腺和凝固腺的分泌物在阴道内凝固而形成的产物，大的阴栓往往向外突出，小的在阴道内或子宫颈处，需要翻开阴道口才能查见，在交配后1小时阴栓渐渐软化，16-24小时后脱落，也有存在4-5小时，最多者存在48小时以上。从而可以在动物合笼后次日清晨检查阴栓，以确定是否进行交配，如有阴栓存在，该日即算妊娠零天。（三）体重的测量每日早上对妊娠雌鼠进行体重测量，制表观察到分娩时的体重变化情况。（四）繁殖与影响因素外部的影响，例如噪音、饮食、光照和群体密度在小鼠繁殖中起着重要的作用，并直接或间接地影响着下丘脑垂体轴对睾丸和卵巢机能的激素控制。小鼠是自发性排卵，排卵并不伴随着每次发情，发情和排卵的周期性是由光照期的昼夜节奏所控制。交配、发情和排卵，最常发生于光照期的暗期。颠倒了明暗周期的时间，也就颠倒了发情、排卵和交配的时间。在保持适当的环境条件时，一些近交系有效繁殖生命近两年。随着母鼠的老化，一窝产仔数（一般1至12只）通常会减少。所以，母鼠一般在一岁时即予淘汰。五、作业：制表观察妊娠期小鼠体重变化（附上面上传的表格）及小鼠受精后阴道图片的情况（略）。12 实验三小鼠早期胚胎发育和胚胎移植（略）一、实验目的与要求：掌握哺乳动物的早期胚胎发育及胚胎移植的操作过程二、实验原理小鼠的早期胚胎，是研究哺乳动物以及人类自身早期发生机理常用的实验材料。胚胎移植，就是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内取出，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使其继续发育为胎儿。胚胎移植技术在畜牧业已开始应用于生产。一些发达国家已有经营奶牛和肉牛胚胎移植的企业公司，向国外销售胚胎。在我国，这一技术的研究起步较晚，1974年在绵羊上获得成功，1978年在奶牛上获得成功，80年代后期90年代初，奶牛、安哥拉山羊和绵羊的胚胎移植开始在生产上应用。胚胎移植术也是显微操作中最基本的实验技术，是从事其它显微操作如嵌合体动物、胚胎干细胞、转基因动物和细胞核移植等实验必不可少的步骤三、实验用品（一）、仪器、用具：解剖镜、显微镜、相差显微镜、注射器（1ml）、4号针头（磨平、末端磨细）、玻璃探针、微吸管（内径0.2mm）、表面皿、培养皿、双孔凹面玻片、外科手术器械（二）、材料：性成熟雌、雄昆明小白鼠。（三）、试剂：孕马血清促性腺激素（PMSG）绒毛膜促性腺激素（hCG）冲卵液（杜氏磷酸缓冲液，pH7.2-7.4）：NaCl8.00gKCl0.20gNaHPO41.15gCaCl20.132gKH2PO40.2gMgCl20.1g将上述药品称好后，放入试剂瓶内，再加重蒸水至1000ml，摇匀，用NaOH和HCl（0.1ml/1L）调pH到7.2-7.4即可使用，也可放入4℃冰箱中保存备用。Whitten氏培养液：NaCl5.14gKCl0.356g12 KH2PO40.162gMgSO4.7H2O0.294gNaHCO31.9g葡萄糖1.0g乳酸钠（60%）3.7ml乳酸钙0.527g丙酮酸钠0.025g青霉素0.075g链霉素0.050g1%酚红1ml小牛血清白蛋白3.0g双蒸水1000ml麻醉剂（乙醚）、石蜡油、外科消毒药品、沙布、药棉等四、实验内容与方法：（一）、人工催情和超数排卵1.小鼠的性别鉴定：成年小鼠的性别较易鉴别。雌鼠可见有明显的阴道开口和明显的五对乳头，雄鼠可见明显的阴囊，仔鼠或幼鼠则主要以它们的外生殖器与肛门的距离来区别，距离近的为雌鼠，距离远的为雄鼠。2.人工催情：12 成年小鼠在非妊娠和非哺乳期间，任何时间都可发情，性周期为4-5天。超数排卵一般选用体重在20-30g的雌鼠，注射孕马血清（PMSG）促使超排。每头雌鼠注射PMSG5-10IU，注射时间可在第一天下午4时左右，注射部位为腹腔。在第三天的下午4时左右腹腔再注射绒毛膜促性腺激素（hCG）5IU，并和雄鼠合笼饲养让其自然交配。第四天上午8时左右检查雌鼠，如有阴道栓形成者，即可供采卵。阴道栓是雌鼠交配后精液与阴道分泌物及阴道上皮等凝结而成的，位于阴道口附近，一般在交配后数分钟即可出现。最初阴栓湿润而软，随后逐渐变硬转为黄色，最后阴栓缩入阴道液化而消失，此过程需10余小时，有的在24-48小时后仍可见。在合笼后每天上午8-9时，下午5-6时检查阴栓，出现阴栓即可认为是妊娠的第一天，即胚龄的第一天。（二）、受精卵及囊胚的获得1.受精卵的获得：将检查有阴栓的小鼠用脊椎脱臼法处死，70%酒精消毒腹部。在腹部中央横剪一小口（0.5cm宽），将两边皮肤肌肉沿切口部剪开，暴露腹部器官；用剪刀和镊子除去卵巢、输卵管和子宫周围的脂肪组织，把输卵管取出，置于盛有培养液的表面皿中。在解剖镜下找到输卵管膨胀的壶腹部，用镊子撕开一小口，卵子即自然流出（见下图）。如受精卵已迁移到输卵管的狭窄部，则可用冲洗法收集受精卵。方法是：在解剖镜下找到输卵管喇叭口，可以用小玻璃探针帮助，将吸有冲卵液的注射器针头对准喇叭口，右手用小镊子轻轻将喇叭口套在针头上，套进约1mm即可，并用镊子把管口轻轻夹住；左手轻推注射器，压出0.5ml冲卵液即可将输卵管中的卵冲出。一般在一侧输卵管中可冲出4-10个卵。收集到的受精卵带有卵丘细胞，必须在含有透明质酸酶（Hyaluronidase,1mg/ml）的培养液中溶去卵丘细胞，再将受精卵换到新鲜的培养液内洗涤3-4次才可用于移植。冲卵液要保持37℃。12 排卵卵子（受精后）2.囊胚的获得：取妊娠第四天的供胚鼠，同法取出子宫，放在消毒滤纸上，吸净子宫周围的血液。用装有冲卵液的注射器针头从上端（即靠近卵巢一端）插入子宫，将胚胎冲入培养皿中。用移卵吸管吸取胚胎放入新的培养液中清洗一下，用于移植。（三）、假孕鼠的制作（选做）1.不育雄鼠：选性成熟且健壮的雄鼠，结扎输精管，恢复2-3周后，与性成熟的雌鼠交配，检查雌鼠有阴道栓但不怀孕产仔。证明结扎手术成功，可作为不育雄鼠或称阉割鼠。2.供胚鼠：选择性成熟且处于发情期的雌鼠，在下午4时左右与雄鼠合笼，第二天早晨挑出有阴道栓者为供胚鼠或称孕鼠。3.假孕鼠：假孕鼠是胚胎移植时的受体。其生殖系统生理状态与移入卵的发育阶段同步，从而为移植的胚胎提供着床和继续发育的条件。一般选择生过一胎，母性较好的雌鼠和阉割鼠合笼，次日上午挑选有阴道栓者为假孕鼠。（四）、胚胎移植（选做）从受精卵到囊胚（受精0.5-3.5天），都可以转移至假孕鼠的生殖管道以完成发育。胚胎移植有输卵管移植和子宫移植两种。单细胞到桑椹期的卵可转移至受孕0.5天的假孕鼠的输卵管。输卵管移植仅适用于被透明带包裹的卵；3.5天的囊胚转移至假孕鼠的子宫。用于子宫移植的胚胎不需有透明带。1.输卵管移植：（1）将假孕鼠麻醉后在背部偏下方表皮，70%酒精消毒。（2）在背腰中央纵向剪开皮肤，开口约为0.7cm。用镊子沿切口剥开皮肤、肌肉，透过肌层可见白色脂肪垫位于脊柱两侧约1cm处。12 （3）在脂肪垫的位置剪开肌肉层，切开0.5cm的小口，用小镊子夹住脂肪组织，把一侧的卵巢、输卵管与子宫一起拉出，固定好，置于显微镜下。（4）用移胚管吸取卵子。可先吸入部分石蜡油，再吸卵以便于控制。吸卵前先吸1个气泡，然后再吸一段培养液，接着吸卵，再吸一个气泡，最后吸进一些培养液。（5）用镊子夹住输卵管喇叭口周围接合部，随即将移胚管插入喇叭口中，轻轻向输卵管内吹气，直至第二、第三个气泡进入输卵管内。移胚管略停一下再行拔出，以防气泡与卵子逸出。（6）将脂肪垫、卵巢、输卵管及子宫等复位，缝合伤口。小鼠苏醒后单笼饲养，18天左右分娩。2.子宫移植：（1）小鼠的麻醉和解剖同输卵管移植。（2）解剖镜下用小镊子夹住子宫上端，在子宫上端血管分布少处，用4号针头刺破子宫壁。拔出针头。（3）用移胚管吸取囊胚，方法同输卵管移植，将移胚管沿原针刺孔隙插入子宫，轻轻将胚胎吹入子宫内。（4）将子宫、输卵管及卵巢等复位。缝合伤口，消毒后等待小鼠苏醒。18天左右分娩五、实验结果：小鼠着床前的胚胎，直径约为90-100微米（包括透明带）。在解剖镜（25×）下，只能看到它的存在，对细胞形态无法辨认。在进行活体观察时，最好用150×或300×的相差显微镜，在视野内可以清楚地看到受精卵和周围的透明带，透明带内有1-2个极体，位于受精卵的一侧。哺乳动物的卵裂是不同步的，2细胞期分裂球近圆形，大小不完全相等，在两分裂球之间有一极体，透明带清晰可见。4细胞期与其他脊椎动物的分裂情况不同，可以看到四个分裂球交错排列。8细胞期，仍可看到极体和透明带。分裂球排列分成上下两层。分裂球均呈圆形。16细胞期为桑椹胚。32细胞期，在分裂球之间出现缝隙，系囊胚腔的开始。72小时后出现完整的囊胚腔，腔的一侧，集中有一群细胞，此即内细胞团。围绕囊胚腔四周的单层扁平细胞，称为滋胚层。此时的囊胚也称胚泡。晚期胚泡的透明带逐渐膨胀分解，在着床前去除透明带的胚泡呈椭圆形。为了观察不同发育时期的胚胎，可以根据小鼠胚胎发育时间表（见附表），定时从孕鼠的输卵管或子宫内将胚胎取出进行观察。小鼠胚胎发育阶段及所处部位时间(hr)发育阶段到达部位12小时以前受精卵壶腹部12-23受精卵输卵管上段23-43.52细胞期输卵管上段43.5-554细胞期输卵管上段或下段55-67.58细胞期输卵管下段67.5-72桑椹胚输卵管下段或子宫上段72-88.5囊胚早期子宫上段88.5-109囊胚晚期子宫下段注：以合笼晚上12点整为受精零时计算12 讲义执笔人：石淳讲义审核人：2009年7月12