生物可降解的热敏性壳聚糖接枝n-(乙烯基己内酰胺)纳米粒子作为5-氟尿嘧啶药物载体的合成和研究

生物可降解的热敏性壳聚糖接枝N-(乙烯基己内酰胺)纳米粒子作为5-氟尿嘧啶药物载体的合成和研究摘要：我们合成了具有纳米结构的5-FU(5-氟尿嘧啶)，利用可生物降解的热敏性壳聚糖接枝N-(乙烯基己内酰胺)生物高分子复合物为载体，将5-FU运送到癌细胞内。利用离子交联法制备了这一热敏性接枝共聚合纳米粒子（TRC-NPs），实验结果显示，其在38℃有一个低临界溶解温度。用交联反应将5-FU药物负载到载体上。体外释药实验表明，在低临界溶解温度以上，药物可明显释放出来。细胞毒试验表明，在100-1000微克/毫升的浓度范围内TRC-NPs对一系列细胞无毒理反应，载药纳米微粒对癌细胞的毒性相对较高，而对正常细胞毒性相对较小。加入若丹明-123染料的细胞里出现绿色荧光，这表明细胞已经吸收了5-FU负载热敏性聚合物纳米粒子（5-FU-TRC-NPs）。细胞凋亡检测试验显示，与正常细胞相比，用5-FU治疗时，癌细胞的凋亡增加。这些结果表明，5-FU-TRC-NPs作为抗癌药物，有广阔的应用前景。关键词：热敏性接枝共聚合纳米粒子；低临界溶解温度；生物材料；抗癌药物1.前言在癌症治疗方面，常用的方法是将药物装入一个热敏性生物可相容的胶囊里，通过血液循环将药物输送到肿瘤部位。甲壳素和壳聚糖是生物相容性、生物可降解并且无毒的高分子化合物。基于这些特性，其在组织工程、创伤修复、药物输送和基因传递方面应用广泛。近年来，人们更多地着眼于水溶性刺激的反应上。研究显示，聚合物系统在应对外部刺激，如温度、PH值、特定的离子和电场时存在阶段过渡状态。在所有的智能高分子的研究中，温度和PH对聚合物的影响备受关注，因为它们是重要的人体生理因素，一些疾病就是因温度或PH或两者的同时变化而引起的。最近，一些研究小组报道了他们利用聚（N-异丙基丙烯酸铵）为基体制备出对温度和PH有感应性的高分子化合物，将其应用于生物医学领域。聚（N-异丙基丙烯酸铵）（PNVCL）是另一种热敏性高聚物，其实际的应用价值体现在它的热敏性、生物相容性和络合能力上，NVCL及其聚合物仅仅应用于化妆品工业生产中，目前还没有报道将纳米结构高聚物和抗癌药物相结合的研究。5-FU，一种嘧啶类化合物，可通过干扰胸甘酸的合成来抑制肿瘤细胞的活性。它的不足之处是：快速代谢造成生物半衰期短；因二氢嘧啶脱氢酶的作用，代谢迅速，而使口服吸收不完整；对健康细胞无选择性。为了延长5-FU的作用时间，提高其疗效，所以将其载入到纳米颗粒载体，以减少5-FU的副作用，从而提高其治疗指数。 5-FU这类疏水性药物，在进入循环系统后会迅速脱离载体而重新分布，与相应的无载体的药物相比更能提高和完善药物的代谢。但是我们所需的治疗肿瘤的药剂要有高度的稳定性，只有温度达到聚合物的最低临界温度时，热敏性的壳聚糖-g-纳米粒子才在靶向癌细胞上释放出来。这种方法使得开发这种热敏性的智能材料成为可能。本文中，我们通过研究集合物载体的低临界溶解温度，介绍了针对输送5-FU药物的智能材料的合成。这种热敏性聚合物纳米材料最重要的优势是它因与可生物相容的壳聚糖基团共轭而有高度可调性和生物降解性。本文中，我们系统研究了5-FU-TRC-NPs的纳米结构、化学稳定性、体外细胞摄取、以及细胞毒作用。2.实验部分2.1合成羧基终止的聚(N-乙烯己内酰胺)(PNVCL–COOH)在异丙醇溶液中采用自由基聚合方法合成PNVCL-COOH。依次将N-乙烯己内酰胺(NVCL)（使用之前用己烷进行重结晶），巯基丙酸（MPA），偶氮二异丁腈(AIBN)(Sigma–Aldrich)溶解在100ml的异丙醇溶液中(MerkCompanyCochin)。在聚合之前先通氮气15min，在75℃下用惰性气体保护反应6小时。反应之后，产物用过量的乙醚进行萃取，然后进行真空干燥。其后，用30ml密理博水进行溶解。在纤维素膜试管中（能拦截1000Da的微粒）用蒸馏水透析三天来除去杂质及未反应的原料。最后在0.085mbar压力和-85℃温度下对产品进行结晶，方便以后的研究。2.2合成壳聚糖接枝聚(N-乙烯己内酰胺)（chitosan-g-PNVCL)常温下，使用EDC/NHS（1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺碘甲烷盐）作为冷凝剂把PNVCL–COOH嫁接到壳聚糖上。首先，一边搅拌一边把壳聚糖溶液滴加到1%的醋酸溶液中。就这样，将PNVCL–COOH水溶液配制好（在密理博水中）。然后，将EDC/NHS（比例：1：2）溶液慢慢地加到混合物中。低转速下常温反应12h。用纤维素膜试管透析三天，后将产品冷冻干燥。2.3空白TRC-NPs的合成将壳聚糖接枝聚合物（1：9的聚合比例）溶解在乙酸中（1%的溶液）并且最后的溶液与磷酸三苯脂以1：1进行交叉结合。将最后的纳米可降解物在30000rpm转速下进行离心分离45min，用水重过滤数次直到PH=7.4。2.4将5-FU加载到TRC-NPs上使用上面提到的简单的离子交联方法使用TPP经过水化过程合成5-FU–TRC-NPs，简而言之，5-FU（1ml水中溶解5mg）与聚合物（10ml乙酸溶液中溶解50mg）在低转速下搅拌5min。另外，整个系统与100mlTPP溶液混合在低转速下搅拌20min。纳米颗粒悬浮物在12000rpm转速下离心分离45min，残渣重过滤直到PH=7.4。2.5低临界溶解温度（LCST）的测定使用分光光度计在0-45℃范围内对LCST系统进行分析。取三个数的平均值作为合成材料的LCST。2.6红外光谱研究用铂金埃尔默光谱RX1设备（4cm-1分辨率，每个样品扫描100次）得到壳聚糖，N-乙烯己内酰胺单体（NVCL） ，PNVCL-COOOH,热-敏性壳聚糖-PNVCL，TRC-NPs，5-FU，5-FU-TRC-NPs的傅里叶变换红外光谱图。2.7冷冻干燥冷冻干燥使用的是自动化系统。简而言之，条件如下：冷凝器温度-85℃，每一步的压力为0.019mbar。将2ml纳米悬浮颗粒放入5ml玻璃瓶中，加入1%的蔗糖作为冷冻保护剂在冷冻过程中保护粒子性质。经过冷冻干燥过的样品在软化水中过滤，然后估测它的尺寸、药物在纳米颗粒时的性质及形态。2.8热分析使用SIITG/DTA6200EXSTAR这个设备进行热分析。使用TG/DTA设备研究制备好的物质的热稳定性及热分解性能。在25℃-500℃之间每10℃扫描一次。2.9纳米颗粒中药物的性质分析（XRD研究）使用x射线衍射仪得到空白5-FU,TRC-NPs及5-FU–TRC-NPs的光谱图像。2.10粒度分析通过动态光散射仪对微粒尺寸进行测量，取三次的平均值。粒子的表面形态通过扫描电子显微镜进行分析。2.11载入效率纳米颗粒制备中药品成分的百分比是通过在20000转速的离心机上离心30min然后分离上清液得到的。将上清液溶解在乙醇溶液中，在265nm波长下用紫外分光光度计进行分析。通过下面的公式计算出的分离效率大约为95%。2.125-FU的体外定量分析为了在试管内定量分析5-FU，需要准备5-FU的标准溶液，即把5mg5-FU溶解在100ml乙醇溶液中。分别取一系列溶液0.2-2ml然后稀释到25ml,用紫外分光光度计在265nm处进行分析,用所得的数据绘成一条直线来定量确定纳米颗粒药品中未知成分的量.2.13体外药物释放取一定量冻干的5-FU-TRC-NPs(50mg)溶解于10ml的磷酸盐缓冲溶液中（PH=7.4）中。将溶液分成30份放在离心管中(每一个500vl),试管放在有两个不同温度的温水浴中(高于或低于临界溶解温度)。将空白5-FU完全溶解在水中,然后在预设好时间间隔的离心机上以5000的转速离心7min，从TRC-NPs中分离出游离的5-FU(会以球状颗粒存在).将游离的5-FU溶解在3ml乙醇中测定在265nm处的分光光谱。2.14细胞培养将MCF7（人类乳腺癌细胞系，NCCS普纳），L929（老鼠纤维原细胞系，NCCS普纳），KB（口腔癌细胞株，NCCS普纳）培养在加有10%牛血清（FBS）的基本培养基中，将PC3（前列腺癌细胞，NCCS普纳）放在含有10%的FBS的Dulbecco修饰的Eagles 培养基中。所有细胞放在含有5%的CO2的细胞培养器中培养。2.15通过荧光显微镜观察细胞的摄取情况将MCF7、L929、KB、PC3以每片5000个细胞的密度接种在酸蚀盖玻片上培养24小时，以便细胞粘附在盖玻片上。培育24小时后将介质拆除，并用PBS缓冲溶液清洗。将盖玻片风干，以数字荧光为媒介将其装在载玻片上，最后将玻片放在荧光显微镜上观察。3.结果与讨论3.1红外光谱研究聚合物系统及其纳米结构PNVCL-COOH的特征吸收峰在1631vmax/cm−1（酰胺I带）和1480vscm-1（CN）处。同时，NVCL单体在1658cm-1（C=C）和3000-3100cm-1（CH=和CH2=）处的吸收峰消失。壳聚糖和壳聚糖接枝PNVCL-COOH的红外光谱图如下。可以看出，壳聚糖接枝共聚物不仅显示出了以下基团的伸缩振动吸收峰：3450cm-1处的—OH，2922cm-1处的脂肪族CH—，1658cm-1处的乙酰氨基，同时显示出了酰胺I带在1631cm-1处的特征吸收带和CN—在2857cm-1处的伸缩峰。5-FU的加载及其纳米粒子的红外光谱分析如下：5-FU加载之后，接枝聚合物的酰胺吸收峰从1629移到1627cm-1处。5-FU中的F原子使得3450cm-1处的峰特别尖锐。1555cm-1处的酰胺吸收峰消失。984和1087cm-1处的峰值代表纳米粒子中剩余的壳聚糖。3.2合成材料的LCST分析壳聚糖-G-PNVCL的低临界温度为38℃。低于此温度，聚合物完全溶于水。随着温度的升高，粒子密度增加。这可能是由于聚合物和水分子之间氢键作用力的减弱导致水凝胶的形成造成的。3.3冷冻干燥把5%的蔗糖溶液放入3ml浓缩纳米粒子悬浮液中，将5-FU-TRC-NPs冻干。结果得到完整蓬松的块状物。在水的悬浮液中对冻干的粒子进行了流体动力学尺寸测定：向块状物中加入水，仅仅通过搅拌就可以使块状物再悬浮，同时，其尺寸增大。3.4合成材料的热分析通过热重分析法，测定了合成物的热稳定性和热降解性。实验表明，壳聚糖的初始降解温度非常接近280℃。由于糖精环的脱水，壳聚糖从140℃到200℃开始缓慢失重，200-310℃失重明显。接枝共聚物的降解情况与壳聚糖相似，但稳定性较差。这表明共聚物是非晶结构的。3.5利用X射线衍射研究药物在纳米粒子中的性质 采用X射线衍射对5-FU-TRC-NPs和空白5-FU及其纳米载体进行对比分析。负载的TRC-NPs比空白TRC-NPs有更宽的X射线衍射谱。这是由于聚合物系统的非晶结构越多，其药物释放能力越强。3.6粒子的大小和形貌TRC-NPs的扫描电镜图片显示，TRC-NPs为平均直径为150nm的球状物。然而5-FU-TRC-NPs的粒径为180-220nm，这可能是由于加载了5-FU的原因。3.7体外药物释放在两个不同的温度下（LCST之上和LCST之下）测定纳米粒子在PBs溶液中的热反应性质。经过3天的实验，在LCST之上有40%的5-FU释放出来，在LCST之下，只有5%的5-FU释放出来。这一结果证实了基于聚合物系统的LCST的药物释放机理。许多因素影响了TRC-NPs和5-FU复合物的形成，包括药物分子中疏水基团的范德华力、PNVCL侧链类型、药物分子中极性基团与壳聚糖分子中羟基间的氢键作用。3个主要机制控制药物分子的释放：侵蚀、扩散和扩散后的膨胀。3.8荧光显微镜使用若丹明-123共轭组研究了细胞摄取情况，并用荧光显微镜观察了染料的变化。从若丹明标记的5-FU-TRC-NPs的荧光图像看出，没有药物的细胞和用空白TRC-NPs培育的细胞均无荧光。若丹明标记的5-FU-TRC-NPs出现绿色荧光。3.9细胞毒性研究研究发现，空白TRC-NPs无明显的细胞毒性。同时发现纳米颗粒载体对L929,KB,PC3和MCF7是无毒性的。5-FU-TRC-NPs对L929的毒性相对较低，而对KB,PC3和MCF7有特殊毒性。4.结论本文合成了可生物降解的热敏性聚合物纳米粒子，对其进行了抗癌药物输送的表征。由于PNVCL的出现，壳聚糖共聚物表现出热敏性，同时在38-45℃的水溶液里确定了它的LCST。在LCST以上5-FU药物释放能力比LCST以下要显著地多。在0.1-1.0mg∕ml的浓度范围内，TRC-NPs对正常细胞和癌细胞均无毒性。5-FU-TRC-NPs对KB,PC3和MCF7有毒性。这些结果表明，5-FU-TRC-NPs可以用作抗癌药物。这种新型的抗癌药物更有利于系统温度可以升高的癌症的治疗。5.存在问题与建议人体温度一般为恒定值，但该药物适宜于在高于人体温度的条件下使用，并且温度升高有利于疾病的治疗。现有技术还无法达到这种条件。参考文献： N.SanojRejinolda,K.P.Chennazhia,S.V.Naira,H.Tamurab,R.Jayakumara,Biodegradableandthermo-sensitivechitosan-g-poly(N-vinylcaprolactam)nanoparticlesasa5-fluorouracilcarrier.CarbohydratePolymers,83(2011)776–786