生物化学实验指导(参考)1

实验二、　紫外吸收法测定核酸的含量一、目的1、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。2、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C一），能够强烈吸收250～280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。它们的经典数值（pH=7.0）如下：DNA的ε（ρ）=6000～8000RNA的ε（ρ）=7000～10000小牛胸腺DNA钠盐溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=6600，DNA的含磷量为9.2%，含1μg/mLDNA钠盐的溶液光密度为0.020。RNA溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=7700～7800，RNA的含磷量为9.5%，含1μg/mLRNA溶液的光密度为0.022～0.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm波长下，浓度为1μg/mL的DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA溶液其光密度为0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg／mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40％，这就是众所周知的增色效应（hyperchromiceffect）。在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应（hypochromiceffect）。蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1∕10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值.在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法事先除去。三、实验材料、主要仪器和试剂（一）试剂1．标准核酸溶液（酵母RNA或小牛胸腺DNA，用0.01NaOH溶液配制成500μg/ml溶液）2．待测核酸样品 （二）器具1、紫外分光光度计2、微量注射器（50μL）3、移液管3．试剂（1）5%～6%氨水：用25%～30％氨水稀释5倍。（2）钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中。四、操作步骤（一）核酸紫外吸收光谱的测定取100μL的RNA溶液于试管中，加入5mL蒸馏水，摇匀，测定核酸溶液在220～290nm波长范围的消光值，再用蒸馏水作空白调零。以该溶液在各波段的光吸收值（即A值）为纵坐标，波长为横坐标，绘制核酸的吸收光谱。（二）核酸溶液含量的测定将上述测吸收光谱溶液的A260直接计算溶液的RNA含量A260五、注意事项如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵——过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液A值作为对照。六、思考题1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？参考答案1．用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。2．当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除。实验三植物体内过氧化氢酶活性的测定一、目的 过氧化氢酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力均有关系，故常加以测定。通过实验可了解过氧化氢酶的作用，并掌握测定过氧化氢酶活性的原理和方法。二、原理过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，以一定时间内分解的过氧化氢量来表示，当酶与底物（H2O2）反应结束后，用碘量法测定未分解的H2O2量。以钼酸铵作催化剂，使H2O2与KI反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应式为：H2O2+2KI+H2SO4—→I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O3—→2NaI+Na2S4O6根据空白和测定二者硫代硫酸钠滴定用量之差，即可求出过氧化氢酶分解H2O2的量。三、材料、仪器设备及试剂1.材料：水稻叶、甘蔗叶及其他植物叶片。2.仪器设备：分析天平；恒温水浴；研钵；100ml容量瓶；100ml三角瓶；滴定管；滴定管架；移液管；移液管架；漏斗；洗耳球等。3.试剂及配制1.8mol·L－1H2SO410﹪(NH4.)6MO7O40.02mol·L－1Na2S2O320﹪KI1﹪淀粉液CaCO3粉石英砂0.018﹪H2O2溶液配制：吸取30﹪H2O2原液0.3ml至50ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后再稀释10倍。四、实验步骤1.过氧化氢酶的提取选取甘蔗功能叶片，擦净去主脉剪成碎片，混匀后迅速称取1g放入经冷冻过的研钵中，加少量CaCO3粉末及石英砂，并加入3～4ml蒸馏水，在冰浴上研磨至匀浆，用蒸馏水将匀浆通过漏斗洗入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀后过滤。然后再取滤液10ml至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即为酶稀释液。2.酶活性测定2.1取100ml容量瓶4个，编号，向各瓶准确加入稀释后的酶液10ml，立即向3、4号瓶中加入1.8mol·L－1H2SO45ml以终止酶活性，作为空白测定。2.2将各瓶放在20℃水浴中保温5～10min（若室温超过20℃则以室温为准）。保温后向各瓶准确加入0.018﹪H2O25ml,摇匀并记录酶促反应开始时间。2.3将各瓶放在20℃水浴中让酶与底物（H2O2）作用5min。时间到后迅速取出，立即在1、2号瓶中加入1.8mol·L－1H2SO45ml以终止酶活性。2.4向4个瓶中各加入20﹪KI1ml和3滴10﹪(NH4.)6MO7O4，摇匀，用0.02mol·L－1Na2S2O3滴定至淡黄色后再加入5滴1﹪淀粉液作指示剂，再用0.02mol·L－1Na2S2O3滴定至蓝色刚消失为滴定终点，记录Na2S2O3用量。五、酶活性计算 空白与样品两个重复滴定值取平均值按下公式计算出过氧化氢酶活性：被分解H2O2（mg）=〔空白滴定值（ml）－样品滴定值（ml）〕×C×17.17被分解H2O2（mg）×酶液稀释倍数过氧化氢酶活性（mgH2O2·g－1Fw·min－1）=————————————————————样品鲜重（g）×酶促反应时间（min）公式中：C－Na2S2O3量浓度17.17—H2O2摩尔质量实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术，了解电泳技术的基本原理，测定人血清中各种蛋白质的相对含量。二、实验原理醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小，厚度为120。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、－球蛋白、－球蛋白、 －球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同（见下表），在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次是球蛋白（如图1）。醋酸纤维薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5条区带，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。人血清中5种蛋白质的等电点及分子量蛋白质名称等电点（pI）分子量 清蛋白－球蛋白－球蛋白－球蛋白4.885.065.126.85～7.506900～200000～30000090000～150000156000～300000三、材料、仪器与试剂（一）、材料：人血清（二）、仪器醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳槽；粗滤纸；直尺和铅笔（三）、药品巴比妥缓冲液(pH8.6I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95％乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸馏水50ml；洗脱液0.4mol／LnaOH；透明液；无水乙醇：冰醋酸＝7：3四、操作步骤1、仪器与薄膜的准备（1）醋酸纤维薄膜的选择与润湿用镊子取一片薄膜，在距醋纤膜一端1.5cm用铅笔作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，小心放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮在液面的薄膜在15～30秒内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此薄膜均匀可以用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹或斑点，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。浸泡于缓冲液中约30分钟，当完全浸透后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，方可用于电泳。（2）电泳槽的准备（如下图）将电泳槽置于水平平台上，将缓冲液注入电泳槽中，两边的电极槽缓冲液的高度要在同一平面。根据电泳槽支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在电泳槽的两个膜支架上,各放2～４层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐, 另一端浸入电极缓冲液中。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。1、点样将点样器先在白瓷反应砖上的血清中沾一下，点样前应在滤纸上反复练习，此步是实验的关键，掌握点样技术后再正式点样是获得清晰区带的电泳图谱的重要环节。薄膜浸泡于缓冲液中约30分钟后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），再在膜条一端2～3厘米处轻轻水平落下并随即提起，使血清完全深透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。2、电泳用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸上，点样面朝下，另一端平贴在阳极端支架上。若膜条与电泳方向不平行,则图谱不整。膜条与滤纸桥之间压严,使膜条绷直,中间不下垂。如有很多膜条同时电泳时,膜条间应相距1～3mm,使之不互相接触,以免相互干扰。盖严电泳室,平衡10分钟后方可通电,否则分离不好。正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V，电流强度0.4—0.7mA/cm膜总宽。电泳时间约为25分钟。4、染色电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5～10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。5、漂洗从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入盛有漂洗液的培养皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。 6、透明将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3分钟后取出平铺在玻璃板上,用一直径0.5cm的玻璃棒将其间的气泡赶出,两者之间不能有气泡。干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫描,长期保存不褪色。7、定量（1）洗脱比色法将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0．4mol／lNaOH4ml,于37℃水浴20分钟(不时振荡)，待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零，读各管吸光度。计算：吸光度总和(T)=++++(吸光度)血清蛋白组分的相对百分数：　正常值清蛋白%=/T×100%54％～73％α1球蛋白％=/T×100%2.78％～5.1%α2球蛋白％=/T×100%6.3％～10.6%β球蛋白%=%/T×100%5.2%～11%γ球蛋白%=%/T×100%12.5%～20%（2）光吸收扫描法将染色干燥的血清蛋白醋纤维素薄膜电泳图谱放入自动光吸收扫描仪（或色谱扫描仪）内，未透明的薄膜通过反射，透明的薄膜通过透射方式进行扫描。在记录仪上自动绘出各组分的曲线图：横坐标为膜的长度，纵坐标为光吸收值；每个峰代表一种蛋白组分，下图为扫描模式图。同时可进行数据处理，以打字的方式显示各组分的相对百分含量。目前，临床检验多采用此法从处理数据。