生物制药工程下游技术

一、概念1、生物制药：是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，利用生物技术的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。2、基因工程：是指在体外按既定的目的和方案，将一目的基因片段，与载体结合，构成DNA重组体，随即引入受体细胞中，随细胞繁殖而扩增，同时也可进行基因表达，产生特定的基因产物或新性状的遗传物质的技术。3、载体：是携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具，载体本质是DNA。4、质粒：是染色体外能自主复制的双链闭环DNA分子。5、沉淀：是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。6、盐析：是一种根据蛋白质在高浓度盐溶液中的溶解度低的特点来分离蛋白质的方法。7、等电点沉淀法：是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。8、凝胶过滤层析：是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。9、离子交换层析：带有不同电荷的物质，对层析柱中的离子交换剂亲和力不同，通达改变冲洗液的离子强度和pH值，将物质依次从层析柱中洗脱分离出来的方法。10、亲和层析：就是根据生物大分特异性的分子识别建立的一种纯化方法11、膜分离：在压力、电场或温差作用下，某些物质可以透过膜，而另些物质则被选择性的拦截，从而使溶液中不同组分，或混和气体的不同组分被分离,这种分子级的分离称为膜分离。12、电泳：在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳。13、分光光度技术：利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法二、简答题1、现代生物制药下游技术包括哪些内容1.生物反应器及大规模细胞培养2.生物细胞破碎技术3.生物分子的分离纯化技术4.生物分子含量检测技术5.生物分子鉴定技术6.生物分子活性检测技术2、基因工程基本操作过程包括目的基因的制备、基因载体的选择、DNA重组、DNA重组体的转化、重组体的筛选和鉴定、外源基因的表达3、生物化学样品制备特点⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活就是生物大分子提取制备最困难之处。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。⑸为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多阶式”进行（常说逐层剥皮式）。常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种分离方法，才能达到纯化目的4、生化分离制备实验设计基本思路⑴确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。⑵建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。⑶通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。⑷生物材料的破碎和预处理。⑸分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。⑹生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。⑺产物的浓缩，干燥和保存。5、蛋白质盐析的原理及优缺点原理：3 蛋白质是由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成的，在水中蛋白质折叠后，由亲水性氨基酸与周围的水分子形成水化膜，因此，蛋白质在水溶液中的溶解度是由它周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，盐对水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，在蛋白质溶液中加入盐后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，实际上是一个去水化的过程。优点：操作简单成本低廉适用范围广环境温和不易造成蛋白质失活缺点：分辨能力差.纯化倍数低沉淀中含盐分较多6、离心操作时应注意哪些事项1、首先应根据实验需求选择合适的转子和转速，不要超过转子和离心机限定的最高转速。2、使用各种类型的离心机都应该在托盘天平上精确配平，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，配平后对称放置在转子中。3、装载溶液时，要根据转速和液体性质选择合适的离心管，确保离心管能承受住，仔细观察离心管有无裂痕或沙眼，以免离心时液体渗出；如液体进入转子造成离心机腔内污染，应立即将之取出，擦拭干净。4、若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。5、启动离心程序后要等离心机达到预设转速平稳运行后才能离开离心机；如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。7、举出4种以上的细胞破碎方法及其特点高压匀浆法：可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌高速珠磨法:可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难喷雾撞击破碎：细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎程度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象。细胞破碎程度可通过无级调节载气压力（流速）控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器的回收。超声破碎:对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作化学渗透：优点（与机械法相比）:对产物释出具有一定的选择性；细胞外形保持完整,碎片少,有利于后分离；核酸释出量少,浆液黏度低,便于进一步提取。缺点：时间长,效率低；化学试剂去除困难且具有毒性；通用性差。酶溶法:利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和，缺点:酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。渗透压冲击法:破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结-融化法:将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。8、凝胶过滤层析的原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定物质的分子量。一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。9、离子交换层析的原理，举例说明原理:是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析纯化血清蛋白质血清中的白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白（血清白蛋白等电点为pH4.9，α及β球蛋白等电点都小于6、γ-球蛋白pl约为7.3）3 10、控制膜污染的注意事项1、膜材料的选择：膜的亲疏水性、电荷性会影响到膜与溶质间相互作用大小，亲水性膜和膜材料电荷与溶质电荷相同的膜较耐污染。2、膜孔径或载留分子量的选择：待分离物质的尺寸大小与膜孔相近时，极易产生堵塞作用。3、膜结构选择：选择不对称孔径的中空纤维超滤膜，用反洗可解决堵塞问题。4、溶液pH控制：调pH值远离被分离蛋白质等电点。5、溶液中盐浓度的影响：无机盐直接对膜影响，无机盐影响蛋白质的溶解性。6、溶液温度影响：温度升高有时有利于超滤，有时不利于超滤。7、溶质浓度，料液流速与压力的控制11、电泳的主要类型及作用自由电泳法:是指在溶液中进行的电泳，不用支持物。在移动界面电泳中，混合物的不同组成成分显示在相对应的运动区域内，而这些运动区域是一个一个部分地重叠着。该法可以确定带电物质的迁移率，并且能用来研究混合物的组成成分，但是它不能用来分离混合物，也不适用于研究低分子量的物质，主要用于蛋白质系统等生物大分子的研究方面。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。12、画制电泳图谱13、分光光度法测定蛋白质的方法Lowry法：是将双缩脲试剂和Ｆolin试剂即磷钼酸—磷钨酸试剂一并加入到蛋白溶液中，蛋白质发生两步反应：一是肽键与碱性硫酸铜发生双缩脲反应；一是蛋白质中的色氨酸和酪氨酸残基与Ｆolin试剂也发生颜色反应，两个反应结果使反应液颜色更深（深蓝色)。反应产物在660nm处测定光密度值，然后在标准曲线图上即查得所测样品中蛋白质浓度。紫外吸收法：蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸含有共轭双键，在280nm处对紫外光具有最大吸收值，且在一定程度上,吸收程度与浓度成正比,利用这一性质，可测定蛋白质的浓度。实验中，核酸在紫外区也有很强的吸收能力，可通过校正加以消除。（一）280nm直接检测法：直接测定标准蛋白质溶液和未知蛋白质溶液在波长280nm处的光密度，然后应用下列公式进行计算得出未知蛋白质溶液的浓度。（二）标准曲线法（三）280nm和260nm的吸收差法：由于核酸在280nm处也有吸收，从而会干扰蛋白质的测定，同时测定280nm和260nm的光密度值，然后算出蛋白质的浓度。1.45×OD280nm-0.74×OD260nm=蛋白质浓度（mg/mL）Bradford检测法：是蛋白质与考马斯亮兰（G-250）结合反应，产生红色至蓝色的有色化合物，当G-250单独存在时为红色，当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。所形成的复合物在595nm处有特异的吸收，因此，可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白含量。3