第一章 应用微生物学的基本技术

应用微生物于志丹齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 第一章应用微生物的基本技术第一节无菌操作技术第二节培养基及其制备第三节微生物分离培养技术第四节种子的扩大培养第五节微生物发酵与控制第六节发酵产物提取与加工 第一节无菌操作技术微生物的研究及应用中，需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养的“纯洁”，防止其被其他微生物污染的技术称为无菌技术。包括环境、培养基及仪器设备的灭菌、无菌空气的制备、接种及培养过程的无菌操作等。 第一节无菌操作技术一、灭菌的概念用物理或化学的方法来杀死或去除物品上或环境中所有微生物的过程；消毒是杀死物品上绝大部分微生物，主要是病原微生物和有害微生物。消毒属于部分灭菌。 第一节无菌操作技术二、灭菌的方法（一）火焰灭菌和干热灭菌1.火焰灭菌如接种针、接种环或其他金属用具等，直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。 第一节无菌操作技术二、灭菌的方法（一）火焰灭菌和干热灭菌2.干热灭菌干燥热空气（170℃）杀死微生物的方法玻璃器皿、金属用具等凡不适用于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。液体培养基、橡胶制品、塑料制品等不能用于干热灭菌。 第一节无菌操作技术二、灭菌的方法（二）湿热灭菌1.常压蒸汽灭菌在常压条件下，在不能密闭的容器内进行灭菌的方法，温度不超过100℃，能杀死大多数微生物。（1）常压蒸汽间歇灭菌100℃维持30～60min，每天一次，连续3天，每次间隙，放在25～30℃条件下培养，第一次杀死营养体、芽孢在培养过程中萌发成营养体，第二次蒸煮即可杀死。（2）常压蒸汽持续灭菌保持充足蒸汽，持续加热6～8h，杀死绝大部分芽孢和全部营养体。 第一节无菌操作技术二、灭菌的方法（二）湿热灭菌2.高压蒸汽灭菌穿透力强、效果最好的湿热灭菌方法。常用于培养基的灭菌。 第一节无菌操作技术二、灭菌的方法（三）过滤除菌（四）紫外线杀菌（五）化学剂消毒杀菌 第一节无菌操作技术三、灭菌在微生物工业中的应用（一）培养基的灭菌1.培养基灭菌温度的选择高温短时灭菌是一种最佳的灭菌方法，一般采用120℃下灭菌。2.灭菌操作方式工业上现行的操作方式主要有两种，即分批灭菌和连续灭菌。分批灭菌：也叫间歇灭菌，操作简单，投资少，灭菌效果好；加热冷却时间长，蒸汽用量不均，锅炉负荷大，适用于小型发酵厂。连续灭菌：对营养物质破坏小，灭菌时间短，设备利用率高，蒸汽用量平衡，适宜自动化控制；设备投资大。 第一节无菌操作技术三、灭菌在微生物工业中的应用（一）培养基的灭菌2.灭菌操作方式连续灭菌流程图： 第一节无菌操作技术三、灭菌在微生物工业中的应用（一）培养基的灭菌3.影响培养基灭菌的几个因素（1）培养基中污染菌的数量与灭菌时间的关系：杂菌数量多，要适当延长灭菌时间；选用高质量的原料。（2）培养基pH值的影响：在pH值6.0～8.0时，微生物最耐热，不易死亡，培养基的pH值愈低所需的灭菌时间愈短。（3）培养基成分的影响：糖类、油脂和蛋白质会增加微生物的耐热性；盐类增加渗透压，促进热的传导，降低耐热性，易于灭菌。 第一节无菌操作技术三、灭菌在微生物工业中的应用（一）培养基的灭菌3.影响培养基灭菌的几个因素（4）培养基中颗粒的影响：颗粒大和结块的传热效果差，灭菌前必须充分搅拌。（5）泡沫的影响：泡沫中的空气形成隔热层，空气的导热差，包裹在泡沫中的微生物不容易被杀死。 第一节无菌操作技术三、灭菌在微生物工业中的应用（二）发酵设备及管道和附属设备的灭菌发酵罐采用空罐或实罐灭菌；管道和过滤器采用蒸汽灭菌；（三）空气除菌1.空气除菌的方法化学药物除菌、辐射除菌、加热除菌、静电除菌、过滤除菌。前四种可用于无菌室、培养室、仓库等的空气灭菌，但不能作为发酵中氧源的除菌。只有介质过滤能达到发酵工业的除菌目的。介质包括：棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维等。 第一节无菌操作技术2.空气过滤除菌工艺流程采气：最好采用含菌数少的空气。前置过滤器：粗过滤器，捕集较大的灰尘颗粒，保护压缩机，防止受磨损，同时减轻过滤器的负荷。空压机：储气罐：消除压缩机排出空气时产生的气流脉冲，维持稳定的空气压力，同时可以利用重力沉降作用去除部分油雾。冷却器：空气经压缩后温度很高，可达120℃，若不冷却会烧焦过滤介质，还会增加发酵罐的降温负荷。气液分离器(油水分离器):加热器:经过分离器的空气湿度还较大，如不加热，只要温度降低，又会有水分析出，使过滤介质受潮而影响过滤效果。总过滤器： 第一节无菌操作技术三、灭菌在微生物工业中的应用（三）空气除菌2.空气过滤除菌工艺流程 第一节无菌操作技术四、微生物的接种技术（一）接种前的准备工作1.无菌室的灭菌熏蒸：常用福尔马林(含37-40%甲醛水溶液)，6-10ml/m3的用量，盛入容器中进行加热，或加半量的高锰酸钾，通过氧化作用加热，使其蒸发。熏蒸后保持密闭12h以上。也可用乳酸、硫磺等进行熏蒸。紫外线灭菌：接种前后，打开紫外灯照射半小时。石炭酸喷雾：操作前，用5%石炭酸溶液喷于接种台面和地面，兼有灭菌和防止微尘飞扬的作用。 第一节无菌操作技术四、微生物的接种技术（一）接种前的准备工作2.无菌室空气污染情况的检验方法：取牛肉膏琼脂和马铃薯蔗糖培养基的斜面和平板各3个，在无菌室内揭开，半小时后盖好。另一份作对照，一并放在30°下培养，48h后检验有无杂菌生长以及杂菌数量的多少。根据检验结果确定采取的措施。霉菌多时，表明室内湿度大，应通风干燥，再进行灭菌；细菌多时，可采用乳酸熏蒸。 第一节无菌操作技术四、微生物的接种技术（二）接种工具 第一节无菌操作技术四、微生物的接种技术（三）接种方法1.试管接种(1)火焰灭菌：接种工具在使用前后都必须通过火焰灭菌；对拔出棉塞后和塞进棉塞前的试管口都要通过火焰灭菌。(2)火焰封口：火焰的无菌区，一般是指外焰周围1cm之间和距外焰顶端3cm之间的区域。 第一节无菌操作技术四、微生物的接种技术（三）接种方法1.试管接种(3)接种的操作：斜面接种、斜面接种平板 四、微生物的接种技术2.液体接种技术斜面接种液体培养基：接种量小和接种量大时液体培养基接种液体培养基：用无菌滴管或移液管吸取菌液接种、直接把液体培养物倒入液体培养基中、利用高压无菌空气通过注液装置把液体培养物注入培养基，或利用负压将液体培养物抽入培养基中等。液体接种固体平板和穿刺：前者用灭菌涂布棒；后者常作为保藏菌种的一种形式。第一节无菌操作技术 四、微生物的接种技术3.固体接种根据所用菌种或种子菌来源不同，可分为以下两种：用菌液接种固体料：种子悬液直接倒入固体料中，搅拌均匀。菌液的水容量要计算在固体料总水量之内。用固体种子接种固体料：包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌等，把接种材料直接倒入灭菌的固体料中，充分搅拌。一般先把种子料和少部分固体料混合后再拌入堆料。第一节无菌操作技术 四、微生物的接种技术3.固体接种固体料接种注意：“抢温接种”：料温高于培养温度5-10度时抓紧接种。接种后即得到适宜的温度条件，从而能迅速生长繁殖，长势好，杂菌不易滋生。此法适用于芽孢菌和产孢子菌的接种。“堆积起温”：大量的固体曲料接种后，不要立即分盘，应先堆积起来，上加覆盖物，防止散热，使培养菌适应新的环境条件，逐渐生长旺盛，产热后再进行分装培养。避免一开始培养菌繁殖慢，料温上不去，拖延培养时间，水分蒸发大，杂菌易发展。第一节无菌操作技术 一、培养基的成分及来源（一）碳源是构成微生物菌体碳架及能量来源。包括糖类、油脂、有机酸、醇类等。糖类使用最广泛，包括寡糖和多糖，一般单糖优于多糖，葡萄糖、果糖优于半乳糖；淀粉优于琼脂等杂多糖。葡萄糖为速效碳源，淀粉为长效碳源。第二节培养基及其制备 一、培养基的成分及来源（二）氮源主要用于构成菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物。1.有机氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、尿素等，含丰富的蛋白质，还有少量的糖类、脂肪、生长因子等。尿素成分单一，加热时不稳定，在生产中受限，在青霉素和谷氨酸生产中常用。2.无机氮源：氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等，微生物利用快，是速效氮源，能引起培养基的酸度变化。第二节培养基及其制备 一、培养基的成分及来源（三）无机盐和微量元素包括磷酸盐、硫酸盐、氯化钠、氯化钾，以及镁、铁、钴、锌、锰等，一般低浓度时对微生物生长有促进作用，高浓度则表现明显的抑制作用。生理功能：构成菌体的原生质成分；作为酶的组分或酶的激活剂，如镁、铁等；调节细胞的渗透压和细胞膜的通透性；参与产物的生物合成。第二节培养基及其制备 一、培养基的成分及来源（四）生长因子生长因子是一类微生物维持正常生活不可缺少、但细胞自身不能合成的有机化合物，包括微生物、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物等。维生素-辅酶的组成成分嘌呤和嘧啶-构成核酸和辅酶第二节培养基及其制备 一、培养基的成分及来源（五）水既是菌体细胞的主要成分，又是一切营养物质传递的介质，而且还直接参与许多代谢反应。第二节培养基及其制备 一、培养基的成分及来源（六）产物形成前体、促进剂、抑制剂1.前体：能直接在生物合成时结合到产物中去，提高产量的物质。如苯乙酸-青霉素G的前体、丙酸-红霉素前体。在生产中为了减少毒性和提高前体的利用率，常用少量多次的方式加入2.促进剂：一类刺激因子，可以影响正常代谢，或者促进中间产物的累积，或提高次级代谢产物的产量。促进剂提高产量的途径：促进生长，提高菌体的抗自溶能力，缩短发酵周期；降低产生菌的呼吸；改善通气效果增加细胞通透性；与产物形成不溶性复盐，降低产物浓度，解除产物对自身的反馈抑制作用。第二节培养基及其制备 一、培养基的成分及来源（六）产物形成前体、促进剂、抑制剂3.抑制剂：抑制某些不需要的产物合成，同时刺激有益于积累产物的代谢途径，促使目标产量提高的一类物质。如四环素发酵中，加入溴化物能抑制金霉素（氯四环素）的形成等第二节培养基及其制备 二、培养基的类型（一）按培养基的物理状态划分1.固体培养基：1.5-2.0%的琼脂，用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检验杂菌、选种育种、菌种保藏等。2.半固体培养基：0.5-0.8%的琼脂，用于观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。3.液体培养基：通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，使营养物质分布均匀。用于大规模工业化生产等。第二节培养基及其制备 二、培养基的类型（二）按培养基的成分划分1.天然培养基：成本低，包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、豆芽汁、玉米粉等。除实验室使用，也适用于工业上大规模发酵生产。2.半合成培养基：马铃薯蔗糖培养基(培养真菌用)等3.合成培养基：也称化学限定培养基，如高氏1号、查氏培养基等，成本高，主要用于有关微生物营养要求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育、遗传分析等方面的研究。第二节培养基及其制备 二、培养基的类型（三）按培养基的功能划分1.选择培养基：使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，提高该菌的筛选效率。利用分离对象对某一营养物质的“嗜好”采用“投其所好”的策略，或在培养基中加入其他微生物的抑制剂。如：以纤维素或石蜡油作为唯一碳源，分离分解纤维素或石蜡油的微生物；加入青霉素、四环素或链霉素，可以抑制细菌和放线菌的生长，将酵母和霉菌分离出来；加入结晶紫，可以抑制革兰氏阳性菌的生长等。第二节培养基及其制备 二、培养基的类型（三）按培养基的功能划分2.鉴别培养基：在培养基中加入能与无色代谢物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌落与外形相似的其他菌落相区分。如：伊红美兰乳糖培养基。用于微生物的快速分类鉴定，以及分离筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。第二节培养基及其制备 二、培养基的类型（四）按培养基用途划分1.孢子培养基：营养不能太丰富；无机盐浓度要适量；注意pH值和培养温度常用的有麸皮培养基、大米培养基、琼脂培养基等2.种子培养基：营养成分丰富和完全；常包括有机和无机氮源，有机氮源利于孢子萌发，无机氮源利于菌体快速生长。第二节培养基及其制备 二、培养基的类型（四）按培养基用途划分3.发酵培养基：含有一定细胞量生长所需的营养物质；含有合成产物所需的特定成分；各成分之间的配比要适当；pH值和渗透压要适当。第二节培养基及其制备 三、培养基配制的基本原则（一）明确目的培养何菌？获得何产物？用于实验室搞科学研究还是大规模的发酵生产？做生产中的种子？第二节培养基及其制备 三、培养基配制的基本原则（二）营养元素的比例协调及浓度配比1.选择适宜的营养成分在实验室中，牛肉膏蛋白胨培养基-培养细菌；高氏1号合成培养基-培养放线菌；麦芽汁培养基-培养酵母菌；查氏合成培养基-培养霉菌。在工业生产中，尽量利用廉价且易于获得的原料。2.营养物质浓度及配比合适浓度过低不能满足正常生长所需，过高起抑制作用。注意碳/氮比。第二节培养基及其制备 三、培养基配制的基本原则（三）物理化学条件适宜各种微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，细菌：7.0-8.0；放线菌：7.5-8.5；酵母：3.8-6.0；霉菌：4.0-5.8。通常在培养基中加入pH缓冲剂。（四）其他注意：灭菌对培养基的影响；培养基的保存，避免形成沉淀；最好现用现配；避免阳光长时间照射等。第二节培养基及其制备 三、培养基配制的基本原则原料要求：以粗代精、以废代好、以简代繁、以纤代糖、以国代进。第二节培养基及其制备 四、培养基的制备（一）原料的预处理微生物不能直接利用或仅能微弱利用一些成分复杂的有机物原料，所以这些原料使用前要进行预处理。培养食用菌-培养基要建堆发酵；生产酒精等-淀粉先进行蒸煮、糖化等第二节培养基及其制备 四、培养基的制备（二）培养基的配制流程1.称量、溶解2.调节pH值3.过滤和澄清4.分装和加棉塞：注意容量5.灭菌、倒皿与摆斜面第二节培养基及其制备 定义：为了研究某种微生物的特性，或者要大量培养和使用某一种微生物，必须从这些混杂的微生物群中获得纯培养，即从自然界或混有杂菌的培养体中将所需的微生物提纯出来。这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。第三节微生物分离培养技术 一、常用的微生物分离纯化方法(一)稀释混合倒平板分离法1.样品稀释液的制备样品10g和90ml无菌水振荡使细胞分散，连续倍比稀释。2.菌种和培养基混合培养取10倍稀释菌液1ml放入无菌培养皿，加15-20ml选择培养基，混匀，放入培养箱培养。缺点：好氧菌生长易受影响，形成菌落微小难于挑取；倾入培养基时，温度较难掌握。第三节微生物分离培养技术 (二)稀释涂布平板分离法1.样品稀释液的制备样品10g和90ml无菌水振荡使细胞分散，连续倍比稀释。2.涂布法接种分离在无菌培养皿中加入选择培养基，冷却成平板后，吸取0.1ml菌液，涂匀后培养。另一种快速有效地涂布平板法：玻璃涂棒连续涂布分离法第三节微生物分离培养技术 （三）平板划线分离法划线方式：连续划线、平行划线、扇形划线等。此法比较适合含菌比较单一材料的纯化；若材料不单一可进行“挑菌纯化”，结合显微镜检测个体形态特征。此法简便快速。第三节微生物分离培养技术 二、厌氧微生物纯培养技术（一）真空干燥化学吸氧法又称为碱性焦性没食子酸法：在干燥器内使焦性没食子酸与氢氧化钠溶液发生反应，形成易被氧化的碱性没食子盐，后者通过氧化作用形成焦性没食子橙，从而除掉密闭容器中的氧。优点：操作简单；无需特殊及昂贵的设备；缺点：不适用于培养需要CO2的厌氧微生物。第三节微生物分离培养技术 二、厌氧微生物纯培养技术（二）厌氧罐培养法在密闭的厌氧罐中，利用氢硼化钠与水发生反应产生一定量的氢气，用钯粒作为常温催化剂，催化氢与氧化合成水，从而除掉罐中的氧。利用柠檬酸与碳酸氢钠的作用产生CO2，利于需CO2的厌氧菌生长。罐中加入指示剂观察厌氧程度。第三节微生物分离培养技术 二、厌氧微生物纯培养技术（三）厌氧手套箱培养法分为操作室和交换室两部分第三节微生物分离培养技术 三、选择培养分离法根据微生物营养、生理、生长条件特点，进行选择培养分离的方法。或抑制大多数其他微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。（一）利用选择培养基进行直接分离如筛选蛋白酶产生菌；高温菌；抗生素抗性菌；螺旋体、粘细菌、蓝细菌等滑行的微生物等。第三节微生物分离培养技术 三、选择培养分离法（二）富集培养利用不同微生物间生命活动特点不同，创造特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，使其在群落中的数量大大增加，从而分离到所需的特定微生物。可以从物理、化学、生物及综合多个方面进行，如温度、pH值、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。优势：营养和胜利条件的无穷尽组合；还可以用来分离培养设计特定环境中能生长的微生物。第三节微生物分离培养技术 定义：将保存在沙土管、冷冻干燥中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。第四节种子的扩大培养 一、工业生产对种子的要求1.生长活力强，转移至发酵罐后能迅速生长，延滞期短，发酵周期短。2.生理性状稳定。3.抗性强，无杂菌污染。4.有稳定的生产能力。5.菌体总量能满足大容量发酵罐生产的要求。第四节种子的扩大培养 二、种子的制备工艺（一）流程(以抗生素为例)保藏种→斜面种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→三级种子罐培养→发酵罐第四节种子的扩大培养 （二）工艺要点1.接种方法与接种量（1）保藏种到斜面到摇瓶：接种环接种（2）一级摇瓶到种子罐：火焰接种法（3）从种子罐到种子罐：管道化压力差接种法（4）接种量占发酵液体积的1%-20%不等，具体视菌种生长速度而定。2.接种龄一般取对数生长期的种子第四节种子的扩大培养 （三）影响种子质量的因素1.培养基：2.种龄与接种量：3.培养条件：(1)温度：主要是通过影响酶实现的。(2)酸碱度：各种微生物各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH值；另外，菌体代谢也会影响培养基的pH值，有必要加入一定量的缓冲液、生理酸性盐、生理碱性盐等。第四节种子的扩大培养 （三）影响种子质量的因素3.培养条件（3）通气：主要针对需氧菌或兼性需氧菌。不同微生物要求通气量不同，不同生理期对通气量要求也不相同；通气通常要配合搅拌，但不宜剧烈搅拌。（4）泡沫：影响微生物对氧的吸收、妨碍二氧化碳的排出；影响设备的利用率；增加污染的机会等。（5）染菌控制：第四节种子的扩大培养 （三）影响种子质量的因素4.种子罐的级数种子罐级数愈少，愈有利于简化工艺及控制。种子罐的级数取决于菌种的性质，如菌种传代后的稳定性、产生的孢子数、菌丝繁殖速度以及种子培养液的最低接种量和种子罐和发酵罐的容量比。第四节种子的扩大培养 二、种子质量的控制措施（1）精选原料，制好培养基。（2）严格无菌操作，严禁种子污染杂菌。（3）掌握好培养条件。（4）做好生产种子的稳定性检查，定期分离纯化。第四节种子的扩大培养 一、常见微生物发酵类型及设备（一）按培养基性状分1.液体发酵：利用发酵罐进行，是目前发酵工业最主要的发酵方式。2.固体发酵：利用固体培养基进行发酵，是历史最长的一种技术，如白酒的酿造等。对无菌操作不是很严格；发展缓慢；近年由于液体培养消耗大量能源，而且存在环境污染的问题，又引起重视。第五节微生物发酵与控制 （二）按终产品分1.微生物菌体发酵：包括：酵母发酵；微生物菌体蛋白发酵；药用真菌发酵；微生物杀虫剂的发酵。2.微生物酶发酵：工业用酶大多来自微生物发酵。3.微生物代谢产物发酵：以微生物代谢产物为目的的发酵，包括初级代谢和次级代谢产物。4.微生物的转化发酵：利用微生物细胞的酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物，包括：脱氢、氧化、脱水、缩合、脱羧、氨化、脱氨和异构化等。5.生物工程细胞的发酵：利用生物工程技术所得的细胞进行培养，如生产胰岛素、干扰素、单克隆抗体等。第五节微生物发酵与控制 （三）根据对氧需求的不同分1.静置发酵：将培养基盛于发酵槽中，接种后不通入空气进行培养。如酒精、乳酸等发酵。2.通气发酵：属需氧微生物的发酵方式，常分为浅盘液体、浅盘固体、深层固体、深层液体通气发酵4种。第五节微生物发酵与控制 （四）按物料和产物进出方式不同分1.分批发酵：发酵过程中的所有物料(不包括空气、消泡剂、调节pH值的酸碱)一次性加入发酵罐，然后灭菌、接种、培养，最后整个罐的内容物放出，进行产物回收。优点：一次投料、一次接种、一次收获。缺点：产品产量和质量不容易保持恒定；发酵周期较长。第五节微生物发酵与控制 （四）按物料和产物进出方式不同分2.连续发酵：在发酵过程中，以一定速度向发酵罐内连续加入新鲜培养基，同时以相同的速度排出含有产品的培养液，从而使发酵管内的发酵液总量保持恒定，培养物在近似恒定的状态下生长的发酵方式。优点：提供了一个相对恒定的环境，使微生物能保持高速生长，有利于保证产物的产量和质量；微生物稳定的生长环境有利于实现自动化控制；采用多级连续培养可满足微生物不同生长阶段对营养的需求，易于分期管理，减少分批培养中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐的时间，提高了生产效率。缺点：微生物发酵周期长；多次传代会使菌种容易发生变异；物料不断的进出也增加了污染的机会；新旧培养基不容易完全混合，影响培养基的利用。第五节微生物发酵与控制 （四）按物料和产物进出方式不同分3.补料分批发酵：又称半分批培养或半连续培养，是一种介于分批和连续发酵之间的特殊培养模式，是微生物的分批培养过程中向生物反映其中间歇或连续地补加供给一种或一种以上特定的限制性底物，反应结束后一次性排出培养液的操作方式。优点：延长中期的代谢活动，维持较高的发酵产物的增长幅度；与分批培养相比：能使基质浓度保持在较低水平，解除或减小了底物与产物的抑制与阻遏作用；与连续培养相比：不会产生菌种变异、物料污染等问题；终产物浓度高，便于产物分离；应用广泛。缺点：培养物的流加难，只能靠经验操作，很难同步满足微生物生长与产物合成的需要。第五节微生物发酵与控制 （五）发酵设备1.固态发酵设备蘑菇栽培用发酵架与发酵室、酿酒用的发酵缸、制曲用的曲盘等共同特点：发酵工艺难控制第五节微生物发酵与控制 （五）发酵设备2.液态发酵设备统称发酵罐，又叫生化反应器。一个优良的发酵罐应该具有严密的结构，良好的液体混合性能，较高的传质、传热速率，还应配备检测和控制仪表。（1）厌氧发酵设备：特点：要求厌氧环境；不通氧，不需搅拌。（2）好氧发酵设备：通常采用通气和搅拌来增加洋的溶解。又分为：机械搅拌式发酵罐、外部液体搅拌式发酵罐、空气喷射提升式发酵罐。第五节微生物发酵与控制 二、发酵动力学（一）发酵动力学概念发酵过程中的各种环境因素与微生物代谢活动之间相互作用随时间变化的规律就称为发酵动力学。主要包括：细胞生长和死亡；基质消耗的规律；产物合成的规律；微生物消耗氧生成二氧化碳的规律；代谢热生成的规律。研究发酵动力学的步骤：首先找出反应过程变化的理化参数，把这些参数变化与代谢联系起来，找出它们之间相互关系和变化规律；建立各种数学模型反应各参数随时间变化的关系；采用计算机在线控制等重复验证模型的可行性；最后编成调控程序并在生产上应用实施。第五节微生物发酵与控制 （二）发酵动力学分型根据产物形成与底物(尤其是碳源)利用的关系将发酵过程分为三个类型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型(1)第Ⅰ型：又称为生长关联型，产物形成与菌体生长基本平行。产品一般是菌体本身或初级代谢产物，如酵母、乳酸、真菌菌丝等。(2)第Ⅱ型：也叫部分生长关联型，菌体生长出现两个高峰，在这两个高峰，碳源利用率都较高，第一个高峰产物很少或没有，第二个生长高峰，产物高速合成。如丙酸、谷氨酸的发酵。(3)第Ⅲ型：也叫非生长关联型。产物合成与细胞生长和碳源利用无平行关系，产物一般在菌体生长接近或达到稳定期时形成。大部分次级代谢产物属于该型，如多数抗生素、色素、毒素、维生素等。第五节微生物发酵与控制 （三）分批发酵动力学1.微生物细胞生长随时间变化的规律微生物生长过程可分为五个生长期，即延迟期、对数生长期、减速期、稳定期、衰亡期。第五节微生物发酵与控制 （三）分批发酵动力学2.基质消耗与细胞生长以及产物形成的关系生产微生物菌体为Ⅰ型发酵，产物形成与微生物细胞生长同步，分批培养中，稳定期是产物的最佳收获期。生产初级代谢产物为Ⅰ型或Ⅱ型，与菌体相同。次级代谢产物为Ⅲ型发酵，产物与微生物生长无关，产物形成过程与微生物生长不同步，稳定期后期或衰亡期是产物的收获期。第五节微生物发酵与控制 （三）分批发酵动力学2.基质消耗与细胞生长以及产物形成的关系得率系数：表示生成的细胞或产物与营养消耗之间的关系。生长得率系数：在一定时间内，菌体的生长量相对于基质消耗量的得率。产物得率系数：一定时间内，产物生成相对于基质消耗量的得率。在发酵工艺控制上：Ⅰ型发酵-考虑生长；Ⅰ型发酵-要分期控制，生长与合成兼顾，重点放在合成期；Ⅲ型发酵-要分别考虑生长与产物合成的条件，还要延长稳定期，以获得最大产量和效益。第五节微生物发酵与控制 三、发酵的中间控制（一）温度对发酵过程的影响及其控制主要在于影响细胞生长与产物的合成，本质是影响膜通透性与酶的活性1.对微生物细胞生长的影响温度升高，酶促反应速度加快，呼吸代谢加强，微生物生长繁殖加快。随温度的升高，酶失活速度加快，蛋白质变性加快，微生物死亡就加快。高温对发酵不利；微生物对低温的抵抗力比对高温强。第五节微生物发酵与控制 （一）温度对发酵过程的影响及其控制2.对产物的影响影响产物的合成速度：影响产物的合成方向：如四环素发酵中，金色链丝菌既能产四环素，又能产金霉素，低于30度时，合成金霉素能力强，温度超过35度时，金霉素合成停止，只合成四环素。通过改变发酵液的物理性质间接影响产物的合成：如温度能影响发酵液中的溶解氧。温度影响代谢调控：在20度低温下，氨基酸的合成途径的终产物对第一个酶的反馈抑制作用比在37度下更大，所以在抗生素生产中，可以考虑在发酵后期降低发酵温度，使蛋白和核酸的正常合成途径关闭，促使发酵转向抗生素的合成。第五节微生物发酵与控制 （一）温度对发酵过程的影响及其控制3.发酵过程中温度的变化及最适温度的选择影响温度变化的因素主要是发酵热，是生物热、搅拌器与发酵液摩擦产生的搅拌热、蒸发热以及辐射热等的代数和。具体选择时可参考以下几点：①参考生长与合成的主次进行选择(变温培养)：以青霉素生产为例②参考结合其他发酵条件(如溶解氧、培养基成分与浓度等)：如通气较差、培养基浓度过稀或培养基较容易利用时，适当降低最适温度；第五节微生物发酵与控制 （二）pH值对发酵的影响及其调控1.pH值对发酵过程的影响（1）对微生物生长和产物合成的影响：体现在：影响微生物的生长繁殖、影响菌体形态、影响产物的合成、影响生物合成途径（2）机理：影响酶的活性、影响微生物细胞膜所带的电荷、影响培养基中某些营养物和中间代谢产物的解离2.影响pH变化的因素（1）微生物的代谢特征：释放生理酸性或碱性物质（2）培养基的成分：碳源过多导致pH下降；尿素被分解时，铵离子浓度增加，pH上升。故发酵中要考虑C/N比。（3）发酵条件：主要是通气和搅拌。正常情况下葡萄糖氧化生成二氧化碳和水，通气不足产乳酸。第五节微生物发酵与控制 （二）pH值对发酵的影响及其调控3.发酵过程中pH值的调控方法：调节培养基的原始pH值，或加入缓冲液；发酵过程中加弱酸、弱碱；控制发酵液中各营养物的配比，特别要控制C:N比；通过补料调节pH值第五节微生物发酵与控制 （三）溶解氧对发酵的影响及其调控1.影响微生物需氧因素（1）生产菌种（2）菌体浓度（3）菌龄（4）培养基2.溶解氧的控制措施增加搅拌功率、补水稀释培养液、降低培养温度、或提高罐压、增加通气量、通入纯氧等方法。第五节微生物发酵与控制 （四）基质浓度对发酵的影响及其控制1.基质浓度对菌体生长与产物合成的影响基质浓度对菌体的生长关系：曲线图高浓度的基质或产物可导致抑制作用。基质对产物形成的影响：同上，高浓度的基质会引起分解代谢物的阻遏现象。2.补料控制：一般采用中间补料的方法第五节微生物发酵与控制 （五）泡沫对发酵过程的影响及其控制1.机械消泡：靠机械振动或压力变化使泡沫破碎，只能作为一种辅助手段。2.化学消泡：利用化学消泡剂，常用的有两类：天然油脂类、化学合成类-如聚氧丙基甘油醚等第五节微生物发酵与控制 四、发酵生产中的染菌与防止（一）染菌的检查与发现1.平板划线培养或斜面培养检查2.显微镜检查3.肉汤培养法检查第五节微生物发酵与控制 四、发酵生产中的染菌与防止（二）染菌的途径与防止1.培养基灭菌不彻底2.种子带杂菌3.发酵设备和管件灭菌不彻底或设备泄漏4。灭菌操作上的污染5.空气带菌6.发酵液染菌第五节微生物发酵与控制 一、发酵液的预处理与过滤发酵液的特点：1.杂质含量多。对提炼影响较大的是可溶性蛋白，高价金属离子和有机杂质等。2.发酵液中含残糖、植物油等消泡剂，或发酵周期过长，菌体自溶或发酵液染噬菌体后，使得核酸、蛋白质及其他黏性有机物增多，黏性增强，给过滤造成困难。3.有些发酵产物如胞内酶、核酸、蛋白质等细胞内物质，需要先分离收集菌体，并把细胞破碎后才能进一步提取。第六节发酵产物提取与加工 一、发酵液的预处理与过滤（一）发酵液的预处理1.蛋白质的沉淀：可用等电点法、热沉淀和盐析法。还可以加酒精、丙酮等有机溶剂使蛋白变性沉淀。2.高价金属离子的沉淀：加草酸或磷酸生成草酸钙或磷酸钙、镁沉淀，草酸钙还能促进蛋白质的凝固。3.有机杂质的沉淀：发酵液中的有机酸能与钙、锰、锌等离子形成凝胶沉淀。4.细胞破碎：碱或去污剂裂解、酶法、物理法(冻融、超声波破碎)、机械法(振荡摩擦、磨碎法)和脱水干燥法等。第六节发酵产物提取与加工 一、发酵液的预处理与过滤（二）发酵液过滤过滤难度细菌最难、放线菌其次。工业上使用助滤剂：硅藻土、珍珠岩粉、活性炭等，或加入反应剂：磷酸氢二钠和氯化钙，形成磷酸三钙盐沉淀，具有较大的吸附表面，能将菌体及其他悬浮的粒子相互凝聚儿沉淀。第六节发酵产物提取与加工 二、发酵液的提取与精制（一）沉淀法提取根据发酵产物在等电点时，或在一定浓度的有机溶剂、中性盐类中溶解度降低而析出沉淀的原理。如等电点沉淀法、不溶性盐沉淀法、盐析法等。第六节发酵产物提取与加工 二、发酵液的提取与精制（二）色谱分离法1.吸附色谱：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、聚苯乙烯、磷酸钙等。2.离子交换色谱法：利用某些能够离子化的极性物质或两性电解质产物，这些离子可与交换树脂上的离子进行交换，从而把溶液中的离子交换到树脂上去，再用另一种对树脂有重大亲和力的离子溶液把产物从树脂上洗脱下来。3.凝脂层析：凝胶分子筛、凝胶渗透层析。如葡聚糖凝胶等。第六节发酵产物提取与加工 二、发酵液的提取与精制（三）萃取法提取利用各种溶质在不同溶剂中的溶解度不同。有机溶剂萃取法：适用于加入有机溶剂不会变性失活且亲水性不太强的生物大分子双水相萃取法：利用两种亲水聚合物的水溶液混合时，会形成两相，不同溶质在这两相中的溶解度不同而分离纯化。适用于提取易失活的、亲水性较强的不易溶于有机溶剂的生物大分子物质。第六节发酵产物提取与加工 二、发酵液的提取与精制（四）膜分离技术：透析、超滤、电渗析、反渗透等。（五）结晶法：第六节发酵产物提取与加工 三、成品加工根据产品的应用要求，有时还需要浓缩、无菌过滤和加稳定剂等加工步骤。还有的需要结晶、干燥等。第六节发酵产物提取与加工