鬼臼毒衍生物诱导人肺腺癌a549细胞凋亡论文

　　鬼臼毒衍生物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡论文【关键词】鬼臼毒素；肺肿瘤；腺癌；,细胞凋亡；抗原,CD95；基因,BclApoptosisinhumanlungadenocarcinomacelllineA549byderivativeofpodophyllotoxin【Abstract】AIM:TostudytheapoptosisofhumanlungadenocarcinomaA549cellsinducedby2,aderivativeofpodophyllotoxin,andtoobtaininsightsintoitsmolecularmechanismofaction.METHODS:MTTassay,electronmicroscopy,DNAagarosegelelectrophoresisandcellcycleananlysisineapoptosisinA549cells.ExpressionsofBcl2,caspase3andFasproteinseasuredetry.RESULTS:2onstratedtoexertantiproliferativeactivityinadoseandtimedependentmanner.IC50ofA549after24,48,72hexposureto2g/L,.freelorphologicalchangesicroscope;agarosegelelectrophoresisshoentation;cellcycleanalysisindicatedanincreasedSphaseproportion,asatically.Fasproteinexpressionshos;adenocarcinoma;apoptosis;antigens,CD95;genes,Bcl2【摘要】目的：研究鬼臼素衍生物2对人肺腺癌细胞A549的凋亡诱导作用，并对其分子机制进行初步探讨.方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、电子显微镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和细胞周期分析法检测A549细胞凋亡；采用流式细胞术(FCM)测定细胞Bcl2,Fas及caspase3蛋白表达水平.结果：2对A549细胞增殖具有明显的剂量和时间依赖的抑制作用，24,48,72hIC50分别为108.20,41.28,20.67mg/L，电镜观察呈现典型的凋亡形态改变；DNA电泳可见明显的梯状条带；细胞周期分析显示S期细胞数明显增多，出现S/G2期阻滞；2能显著降低Bcl2蛋白表达(P0.05)；Fas蛋白表达水平未见明显变化.结论：2通过诱导A549细胞发生S/G2期阻滞而抑制其增殖，其机制可能与下调Bcl2表达及阻滞细胞周期有关.【关键词】鬼臼毒素；肺肿瘤；腺癌；细胞凋亡；抗原，CD95；基因，Bcl20引言鬼臼毒类化合物用于民间药物治疗已有较长的历史.freelethyl1”,2”,5”,6”tetrahydropyridinenitroxyl4”shiffsbase］4deoxy4demethylepipodophyllotoxin），其同类化合物可显著抑制小鼠移植性肿瘤白血病P388和实体瘤S180，可以诱导Raji细胞、NB4细胞凋亡［2-3］.我们观察了2对人肺腺癌A549细胞的凋亡诱导效应，并对其作用机制进行了初步探讨. 1材料和方法1.1材料鬼臼毒素由兰州大学化工学院合成，用DMSO配成8g/L的贮备液，-20℃冻存备用.MTT购自Sigama公司.流式细胞术（FCM）用单抗（FITC标记的鼠抗人FasmAb和鼠IgG1同型对照，FITC标记的美国仑鼠抗人Bcl2mAb和美国仑鼠抗人单克隆IgG同型对照），为美国Caltag产品.A549细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所.细胞贴壁生长于含100g/L小牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）的RPMI1640（GibcolBRL公司）完全培养基中，用含2.5g/L胰酶的消化液进行传代,置37℃,50mL/LCO2孵箱中培养.实验时选用对数生长期细胞.1.2方法细胞增殖活性检测采用MTT比色法，将细胞密度调整为1×108/L，接种于96孔培养板（Costar），每孔100μL,实验组分别加入不同浓度（10,20,40,80mg/L）2,对照组加入等体积PBS,另设只加完全培养液的调零组,每组4个复孔,饱和湿度条件下,37℃,50mL/L培养箱中培养,分别于24,48,72h加入MTT10μL/孔.继续培养4h，每孔加入100g/L的SDS100μL终止培养，37℃过夜，用酶联免疫检测仪测定570nm波长处A值，计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度（IC50）.细胞经80mg/L2作用48h后用2.5g/L胰酶消化，收集细胞悬液离心（900r/min）5min,30g/L戊二醛固定48h,10g/L四氧化锇染色，经梯度脱水，Epon812包埋，超薄切片，铀铅双染子显微镜（JEM1230，日本电子公司）观察细胞超微结构，美国Gatan公司CCD采集系统照相［4］.收集80mg/L2作用48h后的细胞，常规提取DNA,15g/L琼脂糖凝胶，75V,50mA电泳1.5h，应用凝胶图像分析系统（北京鼎永科技有限公司产品）观察.细胞周期分析，2作用24,48h后，收集A549细胞，PBS洗涤，700mg/L冷乙醇固定，PI染色，FCM（CoulterEPICSXL）检测细胞周期时相的分布.A549细胞经2作用12,24h，收集1×106个细胞，PBS洗涤.加入FITC标记的鼠抗人Bcl2mAb，鼠抗人FasmAb及鼠IgG1同型对照后，FCM分别检测Bcl2,Fas及caspase3蛋白的阳性表达率和平均荧光强度［5］.2结果2.12抑制A549细胞增殖A549细胞经2作用24,48,72h后,代谢MTT的能力明显降低,显示较强的细胞毒性反应,呈剂量效应、时间效应依赖关系,2浓度为X轴，抑制率为Y轴，用Excel作图，分别得到不同时间段的直线回归方程:Y24h=-0.53+0.467X，Y48h=14.872+0.851X,Y72h=33.549+0.796X,由此可得24,48,72h的IC50估计值分别为108.20,41.28,20.67mg/L(图1). 所用统计学软件为SPSS12.0.2.22诱导A549细胞凋亡经不同浓度2处理A549细胞48h后，电镜下依次出现染色质凝集并边集、核碎裂及凋亡小体形成等凋亡的典型形态学改变，其次线粒体肿胀也可见（图2）.2.3对细胞周期的影响经20,40mg/L2作用24,48h后,S期细胞所占比例与对照组比较均增加（P0.01）,且随浓度增高而增多,以40mg/L2作用48h时增加幅度较大,为同期生长的对照细胞的2倍,G2/M期细胞减少显著，提示细胞发生S/G2期阻滞(表1).图12对A549细胞生长的抑制（略）A：正常肿瘤细胞；B：20mg/L2作用后，部分线粒体肿胀；C：40mg/L作用后，出现染色质边集现象；D：80mg/L作用后，有凋亡小体形成.图2A549细胞铅铀双染的电镜照片×8000（略）表12作用后A549细胞的周期分布（略）2.4DNA琼脂糖凝胶电泳2作用48h后出现典型梯状条带（图3）.M:200bpmarker;1:80mg/L;2:40mg/L;3:20mg/L;4:对照组.图32对A549细胞凋亡的影响（略）2.52对A549细胞Bcl2,Fas蛋白表达的影响2处理后的A549细胞，Bcl2蛋白表达在2处理组较对照组显著降低（P0.05）,高剂量2组降低Bcl2蛋白的作用大于低剂量2组,Bcl2蛋白下调以40mg/L2作用12h时最明显,为对照组的3.2倍.2作用前后Fas的表达水平变化不明显（表2）.表22对A549细胞Bcl2,Fas蛋白表达的影响（略）PR：阳性率，MFI：平均荧光强度.3讨论鬼臼毒类衍生物属细胞周期依赖性和特异性抗肿瘤药物，其抗癌机制可能与拓扑异构酶Ⅱ有关［6］，对S末期细胞具有较强的杀伤作用.关于这方面已有较成熟的理论.本实验使用的鬼臼毒的衍生物2对A549细胞表现出了明显的增殖抑制作用和凋亡诱导作用，导致A549细胞出现典型的形态和生化改变.2可使A549细胞发生S期阻滞，提示它可以阻止A549细胞由S期向G2期转变，抑制肿瘤细胞分裂和增殖，这进一步证实了加入氮氧基后的鬼臼毒仍保持了其母体的抗瘤活性.药物诱导肿瘤细胞凋亡的调控机制非常复杂，两种直接途径是死亡受体途径和线粒体途径［7］.Bcl2家族是参与细胞生存或凋亡的重要调节蛋白，与线粒体途径密切相关. Bcl2蛋白分布于线粒体外膜、内质网表面及核膜,具有稳定线粒体膜功能、阻止线粒体释放Caspase及凋亡诱导因子（AIF），细胞色素C等作用.研究发现，位于线粒体膜的Bcl2抗凋亡能力明显高于其他部位［8］.Bcl2蛋白可作用于线粒体通透性转换孔（PTP）相关蛋白，阻止PTP开放，维持ΔΨｍ,从而阻止细胞凋亡早期阶段PTP释放及由此引起染色质浓缩和DNA断裂的蛋白质.另研究显示Bcl2基因过度表达能够维持正常ΔΨｍ,而阻止细胞凋亡［9］.Bcl2抗细胞凋亡的另一个机制是抗氧化力,抑制其诱导细胞凋亡.Bcl2能够抑制Ros诱导细胞凋亡,并认为其可能与线粒体SOD反应而起作用.我们研究发现2可以下调Bcl2蛋白的表达水平，且呈时间、浓度依赖性，推测通过降低Bcl2蛋白的水平引起线粒体内膜通透性的改变及随后的线粒体的释放反应（细胞色素C由线粒体膜间隙进入胞质）是2诱导A549细胞凋亡的机制之一.Fas抗原（APO1或CD95）是细胞表面的一种凋亡信号受体，属于死亡受体途径中的死亡信号蛋白，Fas蛋白表达越高的细胞通过与自身Fas配体相互作用引起细胞自杀性死亡即凋亡的作用越强.我们的实验研究发现，2作用前与作用后Fas蛋白表达水平相对都较低，其原因可能有①Fas可能不参与2诱导的A549细胞的凋亡；②实验重复性差.关于2的研究还在进一步深入中.【