植物生物技术重点

生物技术的定义生物技术(biotechnology)，也称生物工程(bioengineering),是指以现代生命科学为基础,结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理,按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的一系列技术。现代植物生物技术包括：植物组织培养技术，人工种子技术，细胞工程技术，基因工程技术植物组织培养定义在人工操作下把离体植物器官（根、茎、叶、花、果）、植物组织（表皮、胚、胚乳、形成层、愈伤组织）、植物的细胞（游离的体细胞、大小孢子）和植物的原生质体在无菌的条件下培养，使它们继续生长、发育成完整植株的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（Invitroculture）或试管培养植物组织培养在农业生产中的应用育种上的应用：单倍体育种：快速纯化个体，缩短育种年限，提高育种效率等作用。远缘杂交：克服杂交不亲和性，用于植物的远缘杂交；体细胞杂交；胚珠培养。体细胞变异的应用：果树苗木等。单细胞突变体的筛选：抗性育种种子繁育与生产：快速繁育：兰花、香蕉、甘蔗、咖啡等。获得脱毒植株，提高种性：病毒可通过维管束传递，茎尖细胞分裂很旺，几乎没有病毒，如土豆。人工种子：不受气候影响，苜蓿、芹菜、胡萝卜等。植物产品的工厂化生产：喜树的喜树碱（抗癌），人参皂苷，香料植物的香油精。种质资源的保存对于难于产生种子，种子不易保存，或珍稀的植物。番薯的块根保存很难，可以取其茎尖进行组织培养，进行保存培养基种类据其营养水平分：基本培养基、完全培养基据其态相分：固体培养基、液体培养基据其作用分：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基据培养物的培养过程分：初代培养基、继代培养基组织培养中常用的培养基主要有：MS、White、N6、B5、Heller、Nitsch、Miller、KM-8PMS培养基--大量元素。特点：无机盐的浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，这使得它营养丰富，不需要添加更多的有机附加物，就能满足植物组织对矿质营养的要求，有加速愈伤组织和培养物生长的作用，当培养物久不转移时仍可维持其生存N6培养基特点：KNO3和(NH4)2SO4含量高，不含钼。目前在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养B5培养基 特点：含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用，但它适合于有些植物如双子叶植物特别是木本植物的生长。灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体，即所有生命的物质全部杀死。物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌(烘烧和灼烧)、湿热灭菌、辐射(紫外线、超声波、微波)灭菌、过滤灭菌。化学灭菌：酒精、升汞、过氧化氢、高锰酸钾、次氯酸钠、抗生素等化学药品处理，根据工作中的不同材料不同目的适当选用。包括：熏蒸灭菌、喷雾灭菌、消毒液灭菌。培养基一般采用湿热灭菌法，压力108kPa、温度为121℃时，维持20min，即可达到灭菌的目的。某些激素（如GA3、ZT、IAA）、抗生素以及某些维生素等，遇热时容易分解，不能进行高压灭菌，用过滤灭菌。外植体消毒外植体的成苗途径：1愈伤组织2胚状体3器官发生4原球茎途径培养基的成分水，无机盐有机成分，植物生长调节剂，碳源，凝固剂其它附加物无机营养：无机物中有16种是植物必须的，即C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织生长和发育会出现一些特殊的症状，如：缺氮：表现出一种很注目的花色素苷的颜色，愈伤组织不能形成导管；缺钾或磷：细胞过度生长，形成层组织减退；缺硫：愈伤组织褪绿；缺铁：细胞分裂停止；缺硼：细胞分裂停滞，细胞伸长；而缺锰铜则会影响细胞伸长。2、有机成分--氨基酸：氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮化合物。有机氮作为培养基中的惟一氮源时，离体组织生长不良，只有在含有无机氮的情况下，氨基酸类物质才有较好的效果。维生素：能明显地促进离体组织的生长。培养基中的维生素主要是B族维生素天然有机物：有机附加物包括有些成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳(CM)、香蕉泥、番茄汁(TJ)、马铃薯泥、苹果汁、生梨汁、西瓜汁、酵母提取液（YE）、麦芽浸出物（ME）等。有机成分--肌醇 肌醇：环己六醇，帮助活性物质作用其他：单核苷酸等。碳源：糖在植物组织培养中是不可缺少的。它不但作为离体组织赖以生长的碳源，且还能使培养基维持一定的渗透压（一般培养基渗透压维持在1.5～4.1MPa）。激素：激素对愈伤组织的诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用.培养基中的关键物质:主要包括生长素、细胞分裂素、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、乙烯。生长素：生长素能影响植物茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落、生根等现象。离体培养中的作用：诱导愈伤组织的产生；促进细胞脱分化；促进细胞的伸长；促进生根。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2，4—二氯苯氧乙酸（2，4－D）。IAA、NAA、IBA、2,4-D之类生长素，可先用少量0.1N氢氧化钠或乙醇溶解，然后再定容到所需要的体积。细胞分裂素：细胞分裂素影响植物细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等。培养基中加入细胞分裂素，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官，分化不定芽。由于这类化合物有助于解除顶端优势对腋芽的抑制作用，可用于茎的增殖。细胞分裂素有天然的和人工合成的。常用的有TDZ、玉米素（ZT）、苄氨基腺嘌呤（6－BA）、激动素（KT）等。激素：组培中决定愈伤组织生根还是生芽的关键取决于细胞分裂素与生长素之间的比率。当配制的培养基中生长素/细胞分裂素的比例高时则有利于生根；生长素/细胞分裂素的比例低时则有利于生芽；若两者浓度相当时，既不利于生根，也不利于生芽，而是愈伤组织的产生占优势。赤霉素能刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株。脱落酸：ABA在植物组织培养中对培养物有间接的抑制作用，它可抑制外植体形成体细胞胚状体。加ABA形成的抑制剂（硝酸银），银离子与ABA的前体相结合，抑制了ABA的形成。水杨酸（阿司匹林）：水杨酸能抑制ABA的形成，有利于胚状体的形成。凝固剂：在固体培养时，琼脂是使用最方便、最好的凝固剂。琼脂是一种高分子的碳水化合物，以色白、透明、洁净的为佳，仅溶解于热水，冷后（40℃以下）即凝固为固体状的凝胶。琼脂糖：原生质体培养时用。Phytogel：新型凝固剂。水：植物组织培养所必需培养基的配制必须用超纯水细胞培养主要用蒸馏水活性碳；活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。活性炭对物质吸附无选择性，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为0.1％～0.5％。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。植物细胞全能性理论（Haberlandt,1902）植物体的每个细胞都具有发育成一个完整植株的潜在能力，细胞的这种特性叫做细胞全能性。 细胞具有这种潜能是因为每个细胞都包含了这个物种的所特有的全套遗传物质，具有发育成为完整个体所必需的全部基因。脱分化：指高度分化的植物器官、组织或细胞，在离体培养条件下经过多次细胞分裂逐渐失去原来的结构、功能和分化状态，形成无组织结构的愈伤组织或细胞团的过程。胚培养分成熟胚培养和未成熟胚（幼胚）培养。胚培养的意义1克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性，获得种间或属杂种2获得单倍体植株3克服种子休眠，提早结实4缩短育种周期，提高育种效率5种子生活力的快速测定6稀有植物品种的繁殖愈伤组织的过程启动期（诱导期）：为细胞分裂做准备，细胞大小不变，合成代谢活跃，RNA含量增加，核体积增大；分裂期：外层细胞开始分裂，细胞变小，当体积最小，细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡，RNA含量最高时，进入高峰；分化期（形成期）：细胞分裂深入到局部内部，形成拟分生组织，最后可以分化成维管组织。酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)：又简称为限制性内切酶或限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。DNA连接酶;一种能够催化在2条DNA链核苷酸5′-磷酸基团和3′-OH之间形成磷酸二酯键的酶DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子；T4DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所以在基因克隆中应用广泛DNA聚合酶:大肠杆菌DNA聚合酶I它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性：以双链DNA为模板，催化单核苷酸通过核苷酸5′-磷酸基团和3′-OH之间通过磷酸酯键结合到引物的3′末端，并不断延伸；5′-3′外切酶活性：该活性能够保证DNA分子从5′→3′方向解离。3′-5′外切酶活性：这种外切核酸酶的活性能够保证被错误连接到DNA链上的核苷酸被切割下来,然后连接上一个正确的核苷酸分子。Klenow片段Klenow片段大肠杆菌聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途：限制性酶消化DNA形成的3′末端补平标记DNA片段的末端cDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定T4DNA聚合酶 T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，和Klenow片段一样具有5′→3′的聚合酶和3′→5′外切酶的活性。外切酶活性比大肠杆菌聚合酶I的高200倍。T4DNA聚合酶还有第三种活力--取代反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出3′→5′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。4）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的发现和纯化对于PCR技术产生和广泛应用（DNA体外扩增、基因克隆等）具有重要的贡献。逆转录酶：是一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementaryDNA)。实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。主要用途是将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。末端转移酶的特性末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到DNA的在3‘羟基，特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有效。最常见的用途是在酶切产生的平末端加尾以便于创造粘性的互补末端载体(vector)：在细胞中能够自主复制的DNA分子，通常用于装载外源的DNA片段或者基因，并转入受体的细胞，使外源DNA分子能够在受体细胞中进行复制。功能：克隆载体：克隆一个基因或DNA片断。表达载体：用于一个基因的蛋白表达。整合载体：把一个基因插入到染色体组中载体应具备的特性1克隆载体的DNA分子上通常含有1个或多个克隆位点供外源的DNA片段插入到克隆载体上。2、携带有外源的DNA片段(基因)进入到宿主细胞中能够进行自我复制，或者外源的DNA片段能够整合染色体随着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。3、载体必须具有可供选择的标记,如抗生素标记。4、载体必须是安全的,不含有对受体细胞有害的基因,对于细胞的生长不会产生显著的影响。质粒载体理想的质粒载体1、分子量小，多拷贝，易操作；2、本身能进行自我复制；3、具有一种或多种酶单切位点；4、具有2个或多个选择标记基因质粒载体的构建的基本原则1、质粒载体具有能自我复制的元件，自我增值的基本条件，一般具一个复制子；ori。2、质粒载体上具有允许外源基因插入的多克隆位点；3、质粒载体上同时必须有可供筛选的抗生素标记，Ampr、Kanr；4、构建的质粒载体应该足够小。 其它：强启动子；增强子；强终止子。质粒载体的一般生物学特性质粒DNA的自主复制：严谨型（<10拷贝）、松弛型（>10拷贝）2、质粒DNA的不亲和性：能够在同一个宿主细胞中共存的不同的质粒称为亲和性质粒,不能在同一个宿主细胞中共存的质粒称为不亲和性质粒。一种质粒与其衍生的质粒之间或亲缘关系较近放入往往为不亲和性的质粒。DH5α3、质粒的DNA接合性：使遗传物质从宿主细胞向受体细胞中转移。λ噬菌体载体噬菌体生长周期：溶菌周期和溶源周期溶菌周期：指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。噬菌体的特征：烈性噬菌体：只有溶菌生长周期的噬菌体。温和噬菌体：只有溶源周期的噬菌体。溶源性细菌：整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌。原噬菌体：在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA。λ噬菌体的特征：噬菌体的DNA分子注入细菌细胞；噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体；细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。λDNA：线状双链DNA分子，约为48kb，在两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。注入到寄主细胞中后，可以通过粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。通过粘性末端互补形成的双链区称为cos位点(cohesiveendsite)。λ噬菌体载体的改造①引入可供筛选的标记基因；②剔除不必要的序列和酶切位点,引入新的酶切位点；载体片段的连接。载体环化后转入到宿主菌中进行繁殖λ噬菌体载体的主要用途是构建cDNA文库。柯斯质粒载体柯斯质粒是一类人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体多克隆位点区含有cos位点的λDNA区具有质粒载体的自我复制起点ori和抗性标记区被用于基因组文库的构建工作特点： 具有λ噬菌体的特性：柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。具有质粒载体的特性：能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因和多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。高容量的克隆能力：cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。人工染色体载体（BAC）来源：E.coli的性因子小F1因子为基本骨架。容量：插入达300kb左右的DNA片段应用大规模的作图与测序：基因组物理图谱的构建；基因组测序；图位克隆基因：用该方法克隆基因无需知道基因产物等信息,只需知道该基因在染色体上的位置；着丝粒的研究；BAC-FISH对重要基因进行定位；利用BAC-FISH对近缘种进行比较物理定位和作图基因文库（genelibrary）是指汇集了某一生物基因组DNA全部序列的重组体DNA群体（转化子群）。基因组文库的大小（即应该包含多少个独立的克隆）与基因组本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有关。植物基因组文库的构建的步骤：1、大片段DNA克隆载体的准备；2、大分子质量的植物基因组DNA制备；3、大片段DNA分子的部分酶切；4、载体与外源片段的连接；5、载体的遗传转化；6、克隆的挑取和验证及植物基因组文库的保存基因组文库的构建基本原则①文库能够覆盖整个基因组；水稻：430Mb；人类：2.9Gb；②插入的片段比较大：文库比较稳定,且容易保存。植物组织培养过程: 外植体愈伤组织器官或胚胎完整植株脱分化再分化脱分化再分化激素激素基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟。根癌农杆菌转化的具体技术--水稻为例(1)水稻愈伤组织的诱导与继代(2)农杆菌的制备(3)水稻愈伤与农杆菌的共培养(4)洗菌(5)抗性愈伤组织的筛选(6)愈伤组织的分化(7)再生植株的生根、炼苗和移栽土壤农杆菌Ti质粒转化系统的优点：1）该转化系统是天然的转化载体系统，成功率高，效果好；（2）目前对该转化系统的研究最清楚，方法最成熟，应用也最广泛；（3）Ti质粒的T-DNA区可以容纳相当大的DNA片断插入，目前已把长达50kb的异源DNA序列通过T-DNA完整地转移到植物细胞中；（4）T-DNA上含有引导DNA转移和整合的序列，以及能够被高等植物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入到T-DNA区的外源基因能够随同T-DNA一道在植物中表达；（5）整合进植物基因组中的T-DNA及插入的外源基因可以根据不同的需要，通过连接不同的启动子进行特异表达；（6）外源基因多以单拷贝插入，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此较好地为育种提供可选育的材料。发根农杆菌入侵植物伤口后，不是产生瘤，而是产生大量不定根，呈毛状，称毛状根或发状根。这是由于发根农杆菌细胞中Ri质粒（root-inducingplasmid）决定的。发状根实际上是单个转化细胞的克隆体。Ri质粒与Ti质粒非常相似，同源性高，经改造后也形成共合载体和双元载体。发根农杆菌介导基因转化方法也与根癌农杆菌基本相同。发根农杆菌Ri质粒转化系统的优点： ①发根的形成为转化体的识别和筛选提供了方便；②发根的单细胞克隆性质可避免出现嵌合体；③Ri质粒的T-DNA转化产生的发根较易经体外培养获得再生植株。随着对发根农杆菌及Ri质粒的深入研究，Ri质粒载体作为Ti质粒的补充，在植物基因工程中有广泛的应用前景基因枪转化基因枪法，又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是利用高速微弹（金属离子）直接把目的基因送入完整植物细胞和组织中的一种转化技术。基因枪法是一种全新的基因导入技术，它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞、组织和细胞器。地位：仅次于农杆菌介导法影响基因枪转化的因素：1、金属微粒的影响2、微弹速度的影响3、DNA沉淀辅助剂的影响4、DNA的纯度及浓度对转化率的影响5、植物材料内在的影响基因枪转化的优缺点：基因枪转化的优点：①理论上无寄主限制；②简化质粒构建和转化方法；③避免了农杆菌污染而造成假阳性；④靶受体广泛，如茎尖分生组织、花粉，甚至线粒体、叶绿体。缺点：转化频率低、嵌合体较多、结果的重复性差，且转化的外源基因以多拷贝插入居多，导致基因沉默，遗传稳定性差，而且实验成本较高。（1）PCR扩增通常根据外源基因两端序列设计引物，以待测的转基因植物或组织的DNA为模版进行PCR扩增，如果能获得与外源基因片段大小相同的带则可初步认为外源基因已经转进去RT-PCR：证明外源基因在植物内正常转录生产特异mRNA。转基因育种的优点①不受亲缘关系的限制,可实现动物、植物和微生物间遗传物质的交流,从而充分利用自然界存在的各种遗传资源;②有效地打破有利基因和不利基因的连锁,充分利用有用的基因;③快育种进程,缩短育种年限。