现代分子生物学-第九章

第九章疾病与人类健康9.1肿瘤与癌症癌（cancer）是一群不受生长调控而繁殖的细胞，也称恶性肿瘤。与此相对应的良性肿瘤是一群仅局限在自己的正常位置，且不侵染周围其它组织和器官的细胞。因此，绝大多数癌是由肿瘤细胞经过一系列突变转化而来的。1 经典单基因病。至今已发现6，000余种，主要病因是某个基因位点上产生了缺陷等位基因。多基因病。涉及多个基因及调控这些基因表达的环境因子之间的相互作用。大多数人类疾病，特别是危害较大的高血压、糖尿病、骨质疏松、精神及神经病等，都属于这一范畴。2 获得性（acquired）基因病。主要是由病原微生物感染引起的传染病，虽然不符合经典的“世代遗传”方式，但基本上是病原微生物基因组与人类基因组相互作用的结果，都涉及基因结构与表达模式的改变。3 4 癌基因（oncogene）：促进细胞增生，这类基因往往常发生功能突变。抑癌细胞（tumorsuppressorgene,TSGs）:抑制细胞生长。抑癌基因的活性下降（功能缺失突变）是引起癌变的另一个原因。5 9.1.1反转录病毒致癌基因Rous在1910年发现带有单链RNA肉瘤病毒（一种反转录病毒）的鸡肉瘤无细胞滤液能在鸡体内诱发新的肉瘤。6 该病毒基因组为6-9kb，RNA上的基因数目很少，被包裹在由gag和env两个基因编码的蛋白质外壳中，其中env基因指导外壳蛋白的合成，gag基因则指导“鞘”蛋白的合成，这些“鞘”蛋白好像“道钉”一样“箍”在外壳的表面，维持外壳蛋白结构的稳定性。7 该反转录酶再以病毒RNA为模板，转录出单链DNA分子，利用宿主DNA聚合酶指导合成第二条DNA链，以双链DNA形式整合到宿主细胞基因组中。被整合的反转录病毒DNA分子称为原病毒（provirus），它能指导病毒mRNA的合成，并利用宿主细胞中的蛋白质合成机器，翻译生成病毒外壳蛋白等，最后组装成病毒颗粒。8 图9-2反转录病毒颗粒示意图9 DNA病毒包括乙型肝炎病毒、SV40和多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。RNA病毒主要是反转录病毒。反转录病毒致癌基因（retrovirusonc）可能是研究最多的病毒基因，它们能使靶细胞发生恶性转化。10 反转录病毒的复制是由其自身基因组上pol基因编码的反转录酶指导完成的。当该病毒感染细胞时，pol基因就被宿主的RNA聚合酶II转录，产生polmRNA，并在宿主核糖体上合成包括反转录酶、整合酶等多个病毒复制和整合所需要的酶类。11 图9-3反转录病毒基因结构示意图12 该反转录酶再以病毒RNA为模板，转录出与病毒RNA序列互补的单链DNA分子，并以此为模板，利用宿主DNA聚合酶指导合成第二条DNA链，以双链DNA形式整合到宿主细胞基因组中。13 图9-4反转录病毒插入引起c-myc基因活化的几种可能途径。14 最早研究的致癌基因可能是劳斯氏（Rous）肉瘤病毒中的V-Src基因，编码被称为p60Src的蛋白质。该蛋白是514个氨基酸的磷酸化蛋白，其C端250个氨基酸是活性区域，负责将磷酸基团移到酪氨酸残基上，可使多个靶蛋白发生磷酸化而影响其功能，加速细胞癌变的过程。15 图9-5劳斯氏肉瘤病毒基因结构及c-Src原癌基因的转变16 V-onc基因的起源研究发现，反转录病毒基因组中所带有的onc基因并非来自病毒本身，而是这些病毒在感染动物或人体之后获得的细胞原癌基因。动物或人原癌基因经病毒修饰和改造后，成为病毒基因组的一部分并具有了致癌性，其作用的靶分子也往往发生改变。17 癌基因（oncogene）可分为两大类：一类是病毒癌基因（viraloncogene，V-onc），编码病毒癌基因的主要有DNA病毒和RNA病毒。第二类是细胞转化基因（C-onc），它们能使正常细胞转化为肿瘤细胞，这类基因与病毒癌基因有显著的序列相似性。18 根据反转录病毒转化细胞的能力，可分为：1、急性转化型1）感染动物后，很短时间（几天或几周）就出现实体瘤或白血病。2）所带的癌基因一般位于病毒基因组内部，也可位于基因组的3‘端，但不会插入结构基因内部。3）具有体外转化细胞的能力。19 2、非急性转化型。感染寄主后，需要较长时间（几个月，几年或数十年)才会致癌。20 研究发现，反转录病毒基因组中所带有的onc基因并非来自病毒本身，而是这些病毒在感染动物或人体之后获得的细胞原癌基因。在肿瘤细胞中，“生长控制点”不起作用，所以瘤细胞一直处于细胞周期循环之中。21 细胞数量培养时间（天）癌细胞+血清生长因子癌细胞-血清生长因子正常细胞-血清生长因子正常细胞+血清生长因子22 图9-6上表皮癌的发生过程示意图23 9.1.2原癌基因（细胞转化基因）产物及分类除病毒感染诱发细胞癌变外，许多非病毒因子（如放射性物质、化学试剂亚硝酸、烷化剂等）也能诱导细胞转化。这些因子没有把致癌基因或其他致癌的遗传信息带入细胞，而通过某种激活机制改变了细胞内原有的遗传信息，使细胞发生恶性转化。研究证明，致癌因子导致基因突变。24 图9-7黄曲霉素（aflatoxin）导致细胞发生癌变的分子机制25 根据原癌基因产物在细胞中的位置，分为3类：1、与膜结合的蛋白，主要有erbB、neu、fms、mas和Src基因产物；2、可溶性蛋白，包括mos、sis和fps基因产物；3、核蛋白，包括myc、ets、jun和myb等。26 根据这些蛋白的功能，它们又常被分为6大类，即蛋白激酶类、生长因子类、生长因子受体类，GTP结合蛋白类、核蛋白类和功能未知类（表9-2）。27 9.1.3原癌基因的表达调控原癌基因在正常细胞中通常以单拷贝形式存在，只有低水平的表达或根本不表达。在很多情况下，原癌基因的结构发生了点突变或插入、重排、缺失及扩增等，改变其转录活性。28 图9-8细胞中原癌基因转变为癌基因的主要途径29 1.点突变研究发现，ras基因编码了一个分子量为2.1×104癌蛋白（p21），从人类膀胱癌细胞系T24DNA中克隆的Ha-ras基因能够诱发NlH/3T3细胞转化，而从正常细胞DNA中克隆的该原癌基因没有这种功能。30 人类肺癌细胞系Hs242的转化基因与Ha-ras高度相似，在这个基因中导致转化活性的遗传损伤是第二个外显子中引起p21蛋白第61位谷氨酰胺被亮氨酸所替代的一个点突变，进而引起蛋白质构象的改变，使细胞获得转化活性。31 图9-9ras基因的点突变及转化活性分析。32 2.LTR插入。LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复序列（longterminalrepeat），含有强启动子序列，当LTR插入原癌基因启动子区域或邻近部位后，可从根本上改变基因的正常调控规律。LTR插入到c-myc5’上游启动子附近，使c-myc的转录水平大大增加。33 3.基因重排。正常情况下，c-myc定位于8q24，免疫球蛋白重链基因（IgH）定位于14q32，轻链λ基因（Igλ）定位于22q12，轻链k基因（Igk）定位于2p11，。在Burkitt淋巴瘤中，c-myc易位至IgH、Igk或Igλ的位点，使Ig基因与c-myc相连在一起，Ig基因启动子使原来不表达的c-myc高表达。34 在正常人体细胞中，非受体型酪氨酸蛋白激酶基因abl位于第9号染色体上，表达量极低，不会诱发癌变。在慢性骨髓瘤病人细胞中，该基因却被转移到第22号染色体上，与bcr基因相融合，表达量大为提高。35 图9-10abl原癌基因通过选择性染色体重排转变成细胞癌基因36 4.缺失。很多原癌基因5’上游区存在负调控序列，一旦该序列发生缺失或突变，就丧失抑制基因表达调控的能力。如Burkitt淋巴瘤中C-myc可因负调控序列的缺失或LTR插入破坏其结构而增强表达。5.基因扩增。使每个细胞中基因拷贝数增加，从而直接增加可用的转录模板。37 9.1.4基因互作与癌基因表达1.染色体构象对原癌基因表达的影响。基因表达不仅取决于基因本身及其相邻区域的一级结构，也取决于其空间构象，即基因在染色体上的空间排列和染色质的结构。当两个基因相距太近时，往往不易形成有利于高效转录的空间结构。38 基因与基因之间的间隔距离被定义为“基因领域”（geneterritory）。同一DNA链上两个具有相同转录方向的基因间隔小于一定长度时，影响有效转录所必需的染色质结构的形成，从而使这两个基因中的一个或两个均不能转录或转录活性显著降低，产生所谓基因领域效应（geneterritorialeffect）。39 正常人c-myc定位于第8号染色体，在其两侧分别存在强表达的基因，使c-myc处于两面受夹击的地位。在Burkitt淋巴瘤中，由于发生基因重排，使c-myc基因一侧的强表达基因消失，从而消除了对c-myc的基因领域效应，使后者的转录活性增强。40 小鼠细胞中，c-myc的5’上游区域也存在一个强表达基因，全长15kb，距c-myc只有3kb。很显然，这一间隔距离太短，与基因有效转录应有的最小距离相差甚远，c-myc受基因领域效应的影响非常大，表达受抑制。在小鼠乳腺癌细胞中，上述间隔距离被显著拉长，激活c-myc转录。41 2.原癌基因终产物对基因表达的影响。癌基因产物通过介质传递生长刺激信号的部位有3处：①癌基因产物本身模拟了生长因子，因而与相应的受体作用，以自分泌的方式刺激细胞生长；②癌基因产物模拟了已结合配体的生长因子受体，从而在无外源生长因子时提供了促进细胞分裂的信号；42 ③癌基因产物作用于细胞内生长控制途径，解除此途径对外源刺激信号的需求。人血小板衍生生长因子（PDGF）与猴肉瘤病毒（SSV）的V-ras癌基因产物，上皮生长因子（EGF）与Src及V-erb癌基因产物之间都存在着极高的相似性，表明生长因子与癌基因转化有关。43 3.抑癌基因产物对原癌基因的调控。因为抑癌基因产物能够抑制细胞的恶性增殖，所以它被认为是一种隐性癌基因。当细胞内由于某种原因造成这些基因的表达受抑制时，原癌基因就活跃表达，引起细胞癌变。44 p53基因，Guardianofthegenome1990年，科学家首次发现p53是一个肿瘤抑制基因。缺失该基因时，患Li-FraumeniSyndrome。此外，病人极易患乳腺癌，脑癌和白血病。45 p53基因在星形细胞癌、乳癌、肺癌、肠癌及骨肉瘤中都有高频率缺失现象。从癌细胞中得到的p53基因，其保守序列区有单一位点的突变，推测可能由于这一突变导致p53基因产物结构与功能的改变，失去抑癌活性。46 磷酸化DNA损伤磷酸化与BRCA2及mRAD51协同作用，通过同源重组的方式完成双链DNA损伤修复激活细胞周期调控机制，停止DNA合成，启动DNA损伤修复。47 p53基因中最常见的单碱基突变所造成的氨基酸改变.48 49 p53基因与细胞癌变a.正常情况下，细胞分裂与p53基因无关；b.如果细胞中ＤＮＡ受损，p53基因被激活，使细胞受阻于Ｇ１阶段直到ＤＮＡ被修复或启动细胞凋亡程序；c.如果细胞中p53基因的两个拷贝同时被破坏，细胞可能死于有丝分裂过程中，也可能带着损伤继续分裂，导致恶性肿瘤．50 DNA损伤P53含量升高，G1停滞细胞在DNA修复后继续分裂或者发生细胞凋亡(a)(b)51 没有p53基因没有G1停滞带有DNA损伤的细胞分裂，细胞的倍性发生变化DNA损伤有丝分裂失败,细胞死亡癌变C52 Rb基因是从视网膜纤维瘤中克隆到的另一个抑癌基因，其功能是阻止处于G0/G1期的细胞进入S期，从而控制细胞增殖。正常Rb基因的表达几乎可抑制所有培养细胞的分裂。53 CDK4/cyclinD复合物使pRb磷酸化非活性转录调控因子转录调控因子有活性基因表达，细胞顺利通过一个细胞周期靶基因54 4.外源信号对原癌基因表达的影响。细胞外信号（包括生长因子、激素、神经递质、药物等）作用于靶细胞后，通过细胞膜受体系统或其它直接途径被传递至细胞内，再通过多种蛋白激酶的活化，对转录因子进行修饰，然后激活一系列基因转录。55 图9-11许多原癌基因参与细胞信号转导过程56 香烟食物中的污染物黄曲霉素B1太阳光照射脱氨内源生理代谢，如肝脏解毒功能等脱氨57 9.2人免疫缺损病毒——HIV人免疫缺损病毒（HIV），俗称艾滋病毒（AIDS），诱发人类获得性免疫缺损综合症。该病毒在分类上属反转录病毒科（Retroviridae）慢病毒属中的灵长类免疫缺损病毒亚属。1983年，法国巴斯德研究所的Montaginer和美国国家卫生研究院癌症研究所Gallo等人首次证实HIV是艾滋病的病因。58 HIVI是从欧洲和美洲分离的毒株，与猴艾滋病毒只有约45%的相似性，它的致病力很强，是引起全球艾滋病流行的主要病原。HIV研究主要针对HIVI。HIVII与猴艾滋病毒的相似性高达75%，其毒力较弱，引起艾滋病的病程较长，症状较轻，且主要局限于西部非洲。59 60 9.2.1HIV病毒粒子的形态结构和传染艾滋病病毒粒子是一种直径约为100nm的球状病毒，包被着由两层脂质组成的脂膜，这种结合有许多糖蛋白分子（主要是gp41和gp120）的脂质源于寄主细胞的外膜。蛋白质p24和p18组成其核心，内有基因组RNA链，链上附着有反转录酶。61 HIV依靠血、血制品以及人体分泌的奶液和精液等传播，主要感染T淋巴细胞，也感染B淋巴细胞和单形核细胞等。HIV感染形成多核巨细胞，并导致细胞死亡。HIV病毒可以通过所感染细胞扩散到全身，已在淋巴细胞、脑、胸腺、脾等组织发现了该病毒。自然界广泛存在着突变株。62 图9-12HIV-I病毒粒子结构模型图63 9.2.2HIV基因组及其编码的蛋白1.HIV基因组结构HIV基因组由两条单链正链RNA组成，每个RNA基因组约为9.7kb。在RNA5’端有一帽子结构（m7G5’GmpNp），3’端有多聚(A)尾巴。由5’末端LTR、结构蛋白编码区（gag）、蛋白酶编码区（pro）、具有多种酶活性的蛋白编码区（pol）、外膜蛋白（env）和3’未端LTR组成。64 HIVI基因编码区有很多重叠，尤其在基因组的3’端。HIV基因组中的部分基因如Tat和Rev是不连续的，被插入的内含子分隔成两个外显子。HIVI至少有4个功能性的剪接供体位点和6个受体位点。65 图9-13HIV-I基因组结构及所编码的主要蛋白质66 2.HIV编码的蛋白质及其主要功能HIV的结构蛋白主要包括3个基因。gag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个5.5×104的前体(p55)，然后在HIV蛋白酶的作用下被切割成p17、p24、p15三个蛋白。P24和p17分别组成HIV颗粒的外壳（CA）和内膜蛋白(MA)，p15进一步被切割成与病毒RNA结合的核衣壳蛋白(NC)p9和p7。67 Pol基因编码病毒复制所需的酶类包括逆转录酶p66、整合酶p32。从pol和gag基因重叠区内起始的一段序列为pro基因，它编码蛋白酶p22，在切割HIV蛋白前体的过程中起作用。env编码8.8×104的蛋白质，经糖基化后其相对分子质量增至1.6×105，是HIV包膜糖蛋白Gp160的前体，可进一步被切割成Gp120和Gp41。68 Gp120是外膜蛋白，感染细胞时可与细胞的CD4受体蛋白相结合，并与G蛋白偶联受体（GPCR）家族中的一个跨膜蛋白发生相互作用。Gp41是跨膜蛋白（TM），嵌入病毒包膜脂质中，对HIV的侵染和致病有非常重要的作用。69 图9-14HIVI感染小神经质细胞和巨噬细胞过程中信号传导及与其受体CD4和辅助受体相互作用示意图。70 3.HIV膜蛋白主要功能区（1）主要抗原决定簇：包括V3区（第301-324位的环状肽段）的主抗原决定簇及若干个较弱的决定簇，其中有两个分别位于Gp41的616-632位和724-751位。71 （2）T细胞决定簇：两个辅助性T细胞决定簇T2和T1分别在105-117位的C1区和421-436位的C4区，一个主要细胞毒T细胞决定簇位于第308-322位。另有3个较弱的细胞毒T细胞决定簇在Gp41上。72 （3）CD4受体结合区：该区位于423-427位（C4区）。在上述功能区以外的某些氨基酸突变也能影响gp120的功能，说明上述各功能区发挥作用还依赖于整个分子特定的空间构象。73 9.2.3HIV的复制HIV与受体结合后，病毒核心蛋白和两条RNA链进入细胞。反转录酶以病毒RNA为模板合成单链DNA，并由宿主细胞DNA聚合酶合成双链DNA（原病毒），经环化后进入细胞核并整合到染色体上，随细胞的分裂传代可长期潜伏。74 主要过程如下：①原病毒整合到宿主染色体上，无症状；②原病毒利用宿主细胞的转录和合成系统转录产生病毒mRNA，其中一部分编码病毒蛋白，与基因组RNA组装成新的病毒颗粒，从寄主细胞中释放出来侵染其它健康细胞；③寄主细胞瓦解死亡。75 图9-15HIV-I在人体细胞内的复制和侵染过程示意图76 HIV的感染及致病机理HIV感染人体后大量复制和扩散，血清中出现HIV抗原，从外周血细胞、脑脊液和骨髓细胞中均能分离出HIV,是HIV原发感染的急性期。大约70%以上的原发感染者在感染后2-4周内出现急性感染症状，包括发热、咽炎、淋巴结肿大、关节痛、中枢及外周神经系统病变、皮肤斑丘疹、粘膜溃疡等，持续1-2周后进入HIV感染的无症状潜伏期。77 无症状潜伏期（可长达数年）。此时无任何临床症状，外周血中HIV抗原含量很低甚至检测不到。随感染时间的延长，HIV重新开始大量复制并造成免疫系统损伤。临床上病人感染逐步发展到持续性全身性淋巴腺病（PGL）、艾滋病相关综合症（APC）等，直至发展到艾滋病。78 HIV除在细胞内大量繁殖造成细胞死亡外，还可通过以下几种途径导致免疫功能下降：①HIV粒子表面的gp120蛋白脱落，与正常细胞膜上CD4受体结合，使该细胞被免疫系统误认为病毒感染细胞而遭杀灭；②因T细胞CD4受体被gp120封闭，影响了其免疫辅助功能；79 ③HIV的gp120蛋白可刺激机体产生抗CD4结合部位的特异性抗体，阻断T细胞功能；④带有病毒包膜蛋白的细胞可与其他细胞融合形成多核巨细胞而丧失功能。80 9.2.4HIV基因表达调控HIV的最大特点是含有许多调控基因，它们编码调控蛋白，在病毒RNA的转录、转录后加工、蛋白质翻译、包装以及病毒颗粒的释放等各个过程中发挥重要作用。除HIV自身的调控蛋白外，还有许多寄主细胞的调控蛋白也参与这个过程。因此，HIV复制的调控十分复杂。81 1.LTR序列HIV基因组两端，在HIVI与HIVII及SIV之间的保守性达95%以上。LTR5’端含有HIV基因调控所必需的多个特定调控区（真核类增强子和启动子单位），现根据各区调控功能的异同分为调控单位、核心单位和反式激活效应元件单位，并已在LTR中发现了许多细胞转录因子结合位点。82 图9-16HIV基因组LTR区中的DNA和RNA结合蛋白的作用位点。83 包括：（1）核心调控元件。该元件从LTR起始延伸到-78位核苷酸，至少包含6个可与细胞转录调控因子结合的区域。这些转录因子的结合部位如下：鸡卵蛋白转录因子（COUP-TF），结合于LTR-371～－334位；激活蛋白1（activatorprotein1,AP1），结合于LTR的-347～－329位；84 激活T细胞核因子（NFAT），有两个结合位点，分别在-292~-255位和-216～-203位；上游激活因子(USF)，结合于-173～-160位；T细胞因子-1α(TCF-1α)，结合于-139～－124位；核因子kB(NF-кB)，结合于-104～－81位。除COUP-TF和USF对HIV的转录起负调控作用外，其余均为正调控因子。85 （2）核心转录单位。HIVILTR核心转录单位的结构与其他病毒或细胞启动子的转录起始区相似，有TATA区和SP1结合位点。这些序列对转录的激活具有重要作用，一旦缺失将使LTR失去启动子活性。86 核心转录单位-78～－46位点的富含GC区有3个连续的SP1结合位点(SP1蛋白含有DNA结合结构和两个富含谷氨酰胺的结构域，可形成二聚或三聚体)。3分子SP1与LTR结合后，由于彼此间以及SP1与周围蛋白的相互作用改变了DNA的空间结构，诱导了依赖于DNA的蛋白激酶对SP1的磷酸化作用，激活HIVI基因转录。87 HIVILTR的-28～－24位含有TATA元件，其两侧还有一个CAXXTG的同向重复序列，该重复序列可能是转录因子螺旋-环-螺旋DNA结合蛋白的识别位点。88 （3）反式激活因子应答元件。在HIV基因组+1～+60位的核苷酸序列是反式激活因子（Tat）激活HIVI转录所必需的，称为反式激活应答元件（TAR）。该序列存在于HIV基因组RNA和原病毒DNA上，是HIV复制所不可缺少的重要调控位点。89 2.参与HIV复制的调控蛋白（1）Tat蛋白是一个转录激活因子，在HIVI、HIVII和SIV中高度保守，是病毒复制所必需的。HIVI的tat基因与env编码区有部分重叠，它含有两个外显子，编码了由101个氨基酸残基组成的Tat蛋白。第一个外显子所编码的67个氨基酸组成的多肽同样具有反式激活作用。90 图9-17Tat蛋白的结构示意图91 Tat蛋白有3个功能域：与已知转录调控蛋白激活功能区结构基本一致的酸性氨基酸区，与Tat激活HIVI基因表达有关；富含Cys区，有7个Cys，与二价金属离子结合并形成Tat二聚体。其中有6个是维持Tat活性所必需的，替代任意一个均可使Tat失活但不影响Tat与金属离子结合。该肽段能与3.0×104的寄主细胞核蛋白相结合。92 Tat的第三个功能区由带正电的碱性氨基酸残基构成，行使两个功能：一是+48～+52位的GRKKR序列，是核-核仁定位信号，可介导自身或异种蛋白进入细胞核；二是与TARRNA凸出部的特异性结合，通过Tat第52和第53位Arg残基与后者的磷酸基团相互作用得以实现。93 （2）Tat与TAR对HIV复制的协同调控作用实验表明，Tat和TAR结合并不能有效地激活HIV基因表达：a.TAR序列及完整高级结构的影响。Tat虽能结合环区有突变的TAR蛋白，但此时不能激活HIV的表达。94 b.寄主细胞因子协同作用的影响。在不同细胞内，Tat的活性可有上千倍的差异。Tat与TBPI结合形成复合体而发挥作用，说明Tat与TAR对HIV复制的调控还需寄主细胞编码蛋白的协同作用。95 c.对上游启动子和增强子的依赖。Tat-TAR功能的发挥依赖于其上游的启动子及增强子，当TAR远离上游启动子时，活性迅速下降。增强子SP1序列在Tat诱导细胞中对HIV转录的促进作用大于非激活细胞。NF-кB序列对两种细胞的作用正好与SP1相反。TATA启动子序列的改变对未激活细胞影响很小，却可降低HIV在Tat诱导细胞中的复制。96 （3）Rev蛋白。rev基因由两个外显子组成，分别编码25个氨基酸和91个氨基酸的两个肽段，最终组装成有116个氨基酸、相对分子质量为1.9×104的调控结构蛋白表达活性的Rev蛋白，是一个重要的反式激活因子，调控RNA剪切和运输，与RRE结合增加env的翻译。对HIV的许多调控蛋白编码基因有负调控作用，对其结构蛋白基因有正调控作用。97 图9-18Rev蛋白的结构示意图98 Rev蛋白通过与env和gag/polmRNA上的一段234个核苷酸的Rev效应元件实现其功能，具有HIVI特异性。能增加含有Rev效应原件RNA的稳定性，促进它们向细胞质运转，并通过阻碍剪接子的组装抑制RNA的编辑，增加这些mRNA的翻译，促进HIV基因表达由早期（转录调控蛋白mRNA）向晚期（转录HIV结构蛋白mRNA）的转变。99 Rev蛋白和RRE（RevResponseElement）的结合是通过Rev蛋白中富含碱性氨基酸的一段14肽（EGTRQARNRRRRWR）与RRE二级结构IIB茎区特异性结合实现的。Rev是核蛋白，带有核定位信号。100 图9-19Rev蛋白与REE区的结合。101 第一个Rev与RRE的结合有助于其他Rev蛋白的结合，这些蛋白不是结合在RRE的特异位点上，而是直接结合到第一个Rev蛋白上，形成多聚体。寄主细胞蛋白可结合到Rev蛋白近C端的功能区，协助加工和转运HIVmRNA。102 （4）Nef蛋白。是负调控因子和磷酸化蛋白，相对分子质量为2.7×104，不是HIV复制所必需的，但抑制由HIVLTR特异性转录的HIVI前病毒基因的表达。103 烷基化后定位于细胞膜上的Nef蛋白比未烷基化并弥散于细胞核及细胞质内的Nef蛋白抑制HIVI基因表达的效率高10倍，推测Nef可能是通过膜细胞信使分子获得对HIVLTR的调控作用。104 （5）Vpr蛋白。又称病毒R蛋白，由96个氨基酸组成，存在于病毒颗粒中但不是HIV复制所必需的。含有vpr基因的HIV毒株与无vpr基因的毒株相比，前者在细胞中生长较快，引发细胞病变也较强。Vpr蛋白可作用于HIVI的LTR区，提高HIV复制速度2-3倍，说明Vpr在病毒早期侵染中有作用。105 （6）Vpu蛋白。HIVI特有的膜定位蛋白，编码由81个氨基酸组成的磷酸化蛋白，称为病毒U蛋白。Vpu蛋白的翻译受Rev调控。HIV复制时并不需要vpu基因表达，但若缺失该基因，感染性病毒粒子的产量降低5-10倍，并减少病毒颗粒在细胞膜上的释放。推测该蛋白有利于HIVI病毒粒子的组装、成熟和释放，有助于gp160/CD4复合体的解聚。106 （7）Vif蛋白。是相对分子质量为2.3×104的病毒感染性因子，为HIVI侵染所必需。缺失vif基因的HIVI虽仍在细胞内正常复制并产生病毒粒子，但其侵染性不及野生HIVI病毒粒子的1/1000。Vif蛋白是病毒在巨噬细胞扩散所必须的。107 HIV基因组不到10kb，起调控作用序列不超过其因组总长度的1/10，但是它的调控却非常复杂。病毒编码的调控因子以及宿主细胞调控因子之间，调控因子与顺式元件之间的相互作用保持了HIV基因表达的动态平衡。108 9-20Tat、Rev和Nef对HIV基因表达的影响分析109 9.2.5HIV的感染及致病机理HIV感染人体后立即复制和扩散，血清中出现HIV抗原，外周血细胞、脑脊液和骨髓细胞中均能分离出HIV,是HIV原发感染的急性期。70%以上的原发感染者在感染后2-4周内出现急性感染症状，包括发热、咽炎、淋巴结肿大、关节痛、中枢及外周神经系统病变、皮肤斑丘疹、粘膜溃疡等，持续1-2周后进入HIV感染的无症状潜伏期。110 无症状潜伏期（可长达数年）。此时无任何临床症状，外周血中HIV抗原含量很低甚至检测不到。随感染时间的延长，HIV重新开始大量复制并造成免疫系统损伤。临床上病人感染逐步发展到持续性全身性淋巴腺病（PGL）、艾滋病相关综合症（APC）等，直至发展到艾滋病。111 HIV除在细胞内大量繁殖造成细胞死亡外，还可通过以下几种途径导致免疫功能下降：①HIV粒子表面的gp120蛋白脱落，与正常细胞膜上CD4受体结合，使该细胞被免疫系统误认为病毒感染细胞而遭杀灭；②因T细胞CD4受体被gp120封闭，影响了其免疫辅助功能；112 ③HIV的gp120蛋白可刺激机体产生抗CD4结合部位的特异性抗体，阻断T细胞功能；④带有病毒包膜蛋白的细胞可与其他细胞融合形成多核巨细胞而丧失功能。113 9.2.6艾滋病的治疗及预防迄今为止仍无任何药物可以完全抑制HIV在感染者体内的增殖并彻底治愈艾滋病。目前主要用核苷酸型和非核苷酸型反转录酶抑制来进行治疗。114 115 （a）核苷酸型反转录酶抑制剂。由于它在结构上与脱氧核苷酸的相似性，掺入后使病毒DNA的合成不能进行。（b）非核苷酸型反转录酶抑制剂。与反转录酶相结合，通过限制该酶的移动性而影响它的活性。116 9.3乙型肝炎病毒——HBV病毒性肝炎是严重威胁人类健康的世界性传染病，引起肝炎的病毒通称肝炎病毒（hepatitisvirus）。目前已经知道的至少有甲肝病毒（HAV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、丁肝病毒（HDV）和戊肝病毒（HEV）等5种病毒。117 甲肝病毒属小RNA病毒科，乙肝病毒属嗜肝病毒科，丙肝病毒与黄热病毒和瘟病毒相似，为RNA病毒。丁肝病毒基因组由单链环状RNA分子组成，其外壳能识别乙肝病毒的表面抗原，是一种与乙肝有关的缺陷型病毒，需要有HBV的辅助才能复制增殖。戊肝病毒基因组为单链正链有多聚(A)RNA，球形无包膜。118 9.3.1肝炎病毒的分类及病毒粒子结构1986年，国际病毒命名委员会正式将乙肝病毒定为嗜肝DNA病毒科成员，1990年又将该科病毒分为正嗜肝病毒属和禽嗜肝病毒属，乙肝病毒是正嗜肝病毒属成员。119 HBV完整粒子的直径为42nm，由外膜和核壳组成，有很强的感染性。其外膜由病毒的表面抗原、多糖和脂质构成；核壳直径27nm，由病毒的核心抗原组成，并含有病毒的基因组DNA、反转录酶和DNA结合蛋白等。120 图9-22HBV病毒粒子模型图121 9.3.2乙肝病毒基因组及其所编码的主要蛋白1、基因组结构乙肝病毒的基因组是有部分单链区的环状双链DNA分子，两条单链长度不同。长链L（3.2kb）为负链，而短链S为正链，长度不确定，约为负链的50%-80%。基因组依靠正链5’端约240bp的粘性末端与负链缺口部位的互补维持环状结构。122 在两条链的互补区两侧各有一个11碱基的直接重复序列（5’TTCAC-CTCTGC-3’），分别开始于第1842和1590核苷酸处，称为DR1和DR2。图9-23HBV基因组结构（ayw株）。123 124 自1979年第一次克隆和测定HBVayw亚型全基因组序列以来，已有20多个不同HBV基因组被测定。不同亚型中核苷酸水平的变异约为10%左右。同亚型中变异约为2%，最高达12%。HBV基因组的多态性是该病毒高变异率的分子基础，其生物学意义是近年来HBV研究中的热点之一。125 2、HBV转录产物HBV基因组结构的最大特点是功能单位非常密集，基因组高度压缩，编码区重复利用，被称之为经济型基因组。它的核酸序列全部是蛋白编码区。HBV在感染过程中分别产生3.5kb、2.4kb、2.1kb、0.8kb4种转录产物有多聚(A)尾巴。126 3.5kb和2.1kb转录物由L链而来，2.4kb和0.8kb转录物由S链转录。3.5kbmRNA编码核心蛋白，其3’末端与2.1kbmRNA的3’末端相同，比HBV基因组L链的全长还多200bp以上，推测它的末端部分可能来自共价闭合的双链区。127 2.4kbmRNA编码S蛋白，2.1kbmRNA编码原S1和S2蛋白，而0.8kbmRNA编码X蛋白。上述4种转录产物在病毒感染的细胞中相对含量有明显差异，其中3.5kb和2.1kbmRNA的转录量远远高于2.4kb和0.8kbmRNA。128 3、HBV基因转录的调控（1）顺式作用元件。HBV的4种转录产物虽然有不同的5’末端，但都利用同一终止信号和多聚(A)位点。C启动子调控3.5kbmRNA的转录起始，在1705-1805位核苷酸处。其下游还发现一个有启动子功能的区域，不同的3.5kbmRNA可由不同的启动子控制。启动子上存在类似TATA的序列。129 SP1启动子位于-89～－77核苷酸处，调控2.4kbmRNA的转录起始。含有典型的TATA序列以及与该序列相距45个碱基的肝细胞特异性转录因子HNF1结合位点。HNF1的结合是SP1启动子在分化的肝癌细胞株中高水平转录的必要条件。130 SP2启动子调控2.1kbmRNA的转录起始，在转录起点上游200个核苷酸内，有A-G7个区，通过结合特异性调控蛋白影响转录水平。A-C区在最远端（-168～－68位），若同时缺失，2.1kbmRNA转录下降到30%以下。D区位于-69～-49处，是必需元件。近端的E-G个区位于转录起始位点上游45个核苷酸内。131 F为负调控区，E区能抑制F区的负调控作用并与G区功能互补。B-F4个区可与相同或相似的转录因子结合，若将外源表达的转录因子SP1与病毒DNA进行共转染，可起始HBV基因转录。有实验发现，纯化的SP1可以直接与B、D和F区结合。X启动子位于-24～-124核苷酸处，调控0.8kbmRNA转录过程。132 （2）增强子。HBVDNA中存在两个激活HBV启动子转录的增强子区域。增强子I位于表面抗原基因的3’端，X基因的5’端，与X启动子相重叠。该增强子在肝细胞中对启动子的增强活性是非肝细胞的10-20倍，暗示它具有细胞特异性。可能是HBV病毒嗜肝性的基础。133 增强子I序列中有多种细胞反式作用因子结合位点，NF-la、NF-lb、NF-lc、AP1、C/EBP、EP以及X蛋白等都可以与增强子I相结合。根据主要的核蛋白结合位点，增强子I被分为2C、EP、E和NF-I4个区段。前两者为基础增强子。若在基础增强子上加E和NF-1结合区，该启动子活性可提高10倍以上。134 增强子II位于增强子I下游600碱基处，长148碱基对，根据其与主要核蛋白的结合位点分为A、B两个区。A区为60碱基对，是正调控元件。单独存在时无增强子活性，必须与B区协同作用。B区有88个碱基对，是增强子II的基本单位，单独具有增强子II活性的60%-70%。135 （3）反式作用因子。研究发现，X蛋白不仅能激活HBV自身启动子如C、SP1、SP2和X以及HBV增强子I，还可以激活多种异源启动子和增强子，如β-干扰素、HIVI、SV40早期启动子以及一些细胞因子如I型MHC等的表达。X蛋白虽然具有转录水平上的反式激活作用，但尚未发现它有DNA结合能力，暗示X蛋白必须通过其它蛋白因子起作用。136 分析X蛋白对HBV的作用时发现，增强子I的E元件十分重要，所以将这个由26碱基的元件命名为X应答元件（X-responsiveelement,XRE）。X蛋白与相关细胞因子结合后，在靶序列上发挥作用。XRE有NF-кB、AP1、AP2及CREB类似物的结合序列。X蛋白本身具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。137 4、HBV的编码区及其产物（1）S编码区。S编码区编码乙肝表面抗原蛋白，分别编码由226个氨基酸残基的表面抗原主蛋白（SHBS）、108-115个氨基酸的原S1蛋白和55个氨基酸组成的原S2蛋白3部分组成。S蛋白和原S2蛋白组合在一起被称为中蛋白（MHBS），S蛋白和原S1、原S2蛋白组合在一起时被称为大蛋白（LHBS）。138 SHBS是病毒外壳蛋白和22nm颗粒表面抗原的主要成分，占病毒蛋白的70%-90%，中蛋白和大蛋白则暴露于病毒颗粒表面。表面抗原有很强的免疫原性，是乙肝疫苗的主要成分。139 （2）P编码区。长2532碱基，约占全基因组3/4以上，是最长的编码区，包含全部S编码区并与C和X编码区部分重叠。P编码区由3个功能区和一个间隔区构成，分别为末端蛋白（又称引物酶）、间隔区、反转录酶/DNA聚合酶及RNaseH。末端蛋白是病毒反转录时的引物。P编码区可能先翻译成9.5×105多肽，然后加工成较小的功能型多肽。140 （3）C编码区。该区长639碱基，翻译产物为病毒核心抗原（HBcAg）。其原初翻译产物是前核心蛋白，切除N端19肽和富含精氨酸的C末端后，成为E抗原（HBeAg），分子量为2.2×104蛋白，是核衣壳上唯一的结构蛋白。HBeAg是分泌型蛋白，可在血清中检测到。141 （4）X编码区。是最小的编码区，编码X蛋白，覆盖了负链的缺口部位，虽然长度不等，但主要产物由154个氨基酸残基组成。X蛋白具有反式调控作用，能激活多个同源或异源启动子或增强子，与肝癌的发生相关。142 9.3.3HBV的复制乙肝病毒基因组虽为双链DNA，却通过反转录途径复制。感染宿主后，首先脱掉外壳进入细胞质，基因组DNA进入细胞核，经DNA聚合酶修复正链缺失部分，形成共价闭环状双链DNA作为转录模板。该环状DNA在感染细胞核中大量扩增。143 图9-24HBV基因组复制模型图。144 其次，HBV基因组在宿主RNA聚合酶作用下开始转录，产生各种mRNA，3.5kb产物为前基因组RNA，其5’端自DR1处开始，自5’向3’延伸，经过DR2后继续合成至DR1，最后终止于DR1后85碱基处的TATAAA序列，全长比病毒DNA多130-270个碱基。145 第三步，部分RNA被包装到核心颗粒中并进行反转录。以与母本负链DNA5’端相连接的末端蛋白为引物，在反转录酶作用下，自DR1处开始反转录合成负链DNA。cDNA合成后，由RNaseH将模板（前基因组RNA）降解，但5’端从帽子结构到DR1不被降解区域作为正链合成时的引物。146 第四步，在DNA聚合酶作用下自DR1处开始合成正链，经跳跃传位、又称“引物易位”至DR2。因此，正链5’端覆盖了负链的缺口，维持了双链DNA的环状结构。由于病毒复制增殖过程中不少酶与细胞因子来自宿主细胞，病毒的复制增殖过程也是干扰细胞正常代谢的致病过程。147 图9-25HBV基因组的复制过程。148 9．4人禽流感的分子机制人禽流感(HumanAvianInfluenza,HAI)是人感染AIV（AvianInfluenzaVirus）后引起的以呼吸道症状为主的临床综合症，其病原为正粘病毒科流感病毒A型流感病毒。149 禽流行性感冒(Avianinfluenza，AI)简称禽流感，又名真鸡瘟（Fowlplague）、欧洲鸡瘟、鸡疫等，是由A型流感病毒引起的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度急性传染病。禽流感病毒是人流感病毒株形成的最庞大的基因库，它还能直接使人发病，已成为人类公共卫生事业面临的重大危害之一。150 9．4．1人禽流感病毒特点及分型正粘病毒分为三个属，即AB型感病毒属，C型流感病毒属和类托高土病毒属（Thogotolikeviruses）。病毒颗粒约为80～120nm,典型的病毒粒子呈球状，基因组为多个负链RNA片段组成。AIV属A型流感病毒，是正粘病毒属中唯一感染禽类的病毒。151 一般按病毒粒子表面对红细胞有凝集性的血凝素(hemagglutnin，HA)及能将吸附在细胞表面的病毒子解脱下来的神经氨酸酶类(neuraminidase，NA)糖蛋白对禽流感病毒分为16个H亚型和9个N亚型，再分为上百个血清亚型。导致禽流感暴发的主要是以H5、H7为代表的高致病性禽流感(HPAI)和以H9亚型为代表的低致病性禽流感(LPAI)毒株。152 153 9．4．2禽流感病毒进入细胞及转录与复制H5N1禽流感病毒通过HA蛋白上的凝集素位点与细胞表面含神经氨酸酶的糖蛋白受体结合，通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞。154 转录时，病毒核酸内切酶将宿主细胞mRNA5’端的帽子结构切下作为病毒RNA聚合酶的引物，转录产生6个单顺反子的mRNA，并翻译成HA、NA、NP和三种聚合酶(PB1、PB2和PA)。NS和M基因的mRNA拼接后，每个产生两个mRNA，依不同阅读框架（ORF）翻译产生NS1、NS2以及M1、M2蛋白（表9-8）。155 NA是病毒核衣壳的主要成分，MA是主要结构蛋白，存在于病毒囊膜内侧。PB1，PB2和PA是病毒复制酶的三个主要组分。NS1和NS2为非结构蛋白，在病毒复制早期起作用，NS1调节病毒RNA的合成、PremRNA的运输、剪切及mRNA的翻译过程。NS2蛋白与M1蛋白相互作用,参与病毒复制周期的调控。156 图9－27流感病毒A株进入宿主细胞及其复制过程图示157 9．4．3禽流感病毒感染人类的机制禽流感导致人类流感，目前主要有猪作为中间宿主的混合器假说和禽流感病毒直接感染人（即人本身充当混合器）两种假说。禽流感病毒跨越种属间的屏障从家禽直接感染人与其基因组的分子结构有关。该病毒基因组为分多个片段，极易发生基因交换、重组和变异，导致感染宿主和致病性改变。158 1、HA受体结合位点突变导致禽流感病毒感染人类细胞HA是流感病毒表面主要糖蛋白，在感染过程中起关键作用。HA结合受体位点的第226位氨基酸与禽流感病毒的宿主细胞结合能力有关。若该位点氨基酸残基为谷氨酰胺，表现为SAa22,3Gal受体（禽类呼吸道上皮细胞表面受体）结合特性；159 若该位点为亮氨酸，则表现为SAa22,6Gal受体（人呼吸道上皮细胞表面受体）结合特性；若该位点为甲硫氨酸，对SAa22,3Gal和SAa22,6Gal具有相同的结合能力。160 1997年香港禽流感H5N1病毒就是因为第226位氨基酸由谷氨酰胺突变为甲硫氨酸，导致禽流感病毒直接感染人细胞。对H5及H7亚型高致病力毒株序列分析表明，高致病力毒株的HA在裂解位点附近有多个碱性氨基酸残基，易被宿主蛋白酶系统裂解为HA1和HA2，致病性增强。161 2、PB2蛋白627位点突变导致人禽流感病毒复制能力增强禽流感病毒能否在人体细胞内进行有效复制，主要与病毒复制酶(PB1、PB2和PA)基因有关。当PB2蛋白基因来源于人流感病毒，无论其他基因片段来源于禽流感或人流感病毒，重组病毒在哺乳动物体细胞中都能有效复制；162 当PB2蛋白基因来源于AIV时，重组病毒不能在哺乳动物细胞中进行有效复制。禽流感病毒株PB2第627位氨基酸都是谷氨酸，而人流感病毒该位点上是赖氨酸。香港H5N1毒株中PB2的第627位就由谷氨酸突变成赖氨酸。所以，PB2第627位氨基酸可能是决定A型流感病毒宿主范围的关键位点。163 3、NS1第92位氨基酸突变导致人禽流感病毒致病能力增强普通流感病毒感染时，非结构蛋白(NS1)产生于机体受感染的细胞，与病毒复制产生的双链RNA相互作用，产生的细胞内信号作用于RNA病毒蛋白激酶(PKR)以及核因子NF2KB，干扰素等细胞因子被合成并发挥非特异性免疫作用。164 高致病性人禽流感H5N1亚型病毒感染者体内虽然存在高浓度的干扰素和肿瘤坏死因子2α，却不能杀死病毒，因为这类病毒对细胞因子具有抵抗力。H5N1亚型病毒的非结构蛋白基因（NS1第92位氨基酸）发生变异可能是产生这种现象的原因。目前尚不清楚非结构蛋白变异后，病毒通过何种信号途径逃避细胞因子抗病毒作用。165 9.5严重急性呼吸综合症的分子机制9.5.1严重急性呼吸综合症冠状病毒的结构与分类Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，SARS-CoV，冠状病毒科冠状病毒属。病毒颗粒直径在80-160nm，有囊膜，表面镶嵌有12-24nm的球形梨状或花瓣状纤突，由于囊膜上的纤突呈规则状排列成皇冠状，故称之为冠状病毒。166 ，图9-28冠状病毒颗粒结构示意图167 病毒颗粒的囊膜由两层脂质组成，在两层脂质中镶嵌有两种糖蛋白，纤突蛋白S（又称E2）和血凝素酯酶HE（hemagglutininesterase，又称E3），膜蛋白M（又称E1）和小包膜糖蛋白E（envelopeprotein）。病毒粒子内部为核衣壳蛋白N和核基因组RNA组成的核蛋白核心。168 图9-29SARS-CoV病毒与其它冠状病毒的系统进化分析169 已知冠状病毒分为3组，第1和第2组为哺乳动物病毒，第3组是禽类病毒。序列分析表明，SARS-CoV的基因组序列与其它三组都存在很大差异，很难被归入某一组。SARS-CoV最可能来源于动物，特别是野生动物如果子狸、蝙蝠、猴、蛇等。有学者认为它可能是第2组的重组病毒，也有人认为它可能是新的第4组冠状病毒的代表。170 9.5.2SARS-CoV的基因组结构是目前已知最大的RNA病毒，基因组为单链正链RNA，全长27-30kb，5’端有甲基化帽子，前2/3区域编码病毒RNA聚合酶复合蛋白，后1/3编码S、E、M和N蛋白，在S和E之间、M和N之间以及N蛋白基因的下游有未知功能的开放读码框，其3’端有不少于50个碱基的polyA。171 其结构蛋白mRNA不存在转录后修饰、剪切等过程，而是通过RNA聚合酶和某些转录因子以不连续转录机制，通过识别特定的转录调控序列有选择地从反义链RNA上一次性转录得到完整的mRNA。SARS-CoV全基因组共有14个开放读码框，包膜上有S、M和HE三种主要糖蛋白。172 S蛋白可能是病毒诱发机体免疫系统产生特异性抗体和细胞毒性T细胞的主要抗原蛋白，参与SARS-CoV侵入宿住细胞的过程。S蛋白又分为S1和S2两部分，S1蛋白主要与宿主细胞膜受体结合，S2蛋白介导病毒囊膜和宿主细胞膜融合。173 9.5.3SARS-CoV的侵染过程SARS-CoV的生活周期包括病毒侵染、复制和组装及分泌几个阶段。侵染靶细胞时，病毒首先通过病毒囊膜上的S蛋白与敏感细胞的受体结合，通过其编码蛋白的自身折叠与相互结合牵引将病毒囊膜和细胞膜拉近而发生融合，使病毒遗传物质以内吞作用方式进入靶细胞细。174 ACE2(血管紧张素转换酶Ⅱ)是SARS冠状病毒的一个主要受体。ACE2为依赖于锌离子的金属肽酶，是唯一已知在血压调节中起关键作用的血管紧张素转换酶（ACE）的同系酶，是SARS病毒进入细胞的主要靶点，也是对SARS进行药理干预的首选目标。175 SARS冠状病毒S蛋白的S1亚单位既具有与靶细胞受体结合的功能，又具有中和抗原表位。所以，针对S1亚单位的特异性抗体能够中和SARS冠状病毒感染。176 图9-30冠状病毒的生活周期图示177 SARS-CoV病毒的囊膜蛋白在粗面内质网内翻译，同时发生N-糖基化，并在粗糙内质网表面聚合形成非共价同源三聚体，运输到高尔基复合体中进行高甘露糖低聚糖基化修饰和酯酰化。178 同时，病毒基因组复制，子代基因组RNA通过基因组中的包装信号与新合成的N蛋白结合，形成螺旋状的核衣壳之后再通过M蛋白的作用与囊膜结组装出芽。在病毒粒子的出芽的过程中，M、S、E蛋白嵌入到病毒粒子的囊膜中，形成的子代病毒粒子经细胞膜融合而释放到细胞外完成其生命周期。179 9.6基因治疗人类疾病的发生，其实都是人体细胞中自身基因的改变或由外源病原体基因产物与人体基因相互作用的结果。9.6.1基因治疗的历史沿革1990年，第一次用反转录病毒载体把腺苷脱氨酶基因（ADA）导入来自病人自身的T淋巴细胞，扩增后输回患者体内。5年后，患者体内10%的造血细胞呈ADA基因阳性。180 基因治疗的两大途径exvivo与invivo方式。exvivo途径将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体（异种）被“基因工程化的”细胞，经体外细胞扩增后输回人体。这种方法易于操作，而且因为细胞扩增过程中对外源添加物质的大量稀释，不容易产生副作用。同时，治疗中用的是人体细胞，尤其是自体细胞，安全性好。181 invivo途径将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。用病毒型或非病毒型，甚至裸DNA为载体，有利于大规模工业化生产。治疗基因以及其载体必须证明其安全性，而且导入体内之后必须能进入靶细胞，有效地表达并达到治疗目的。182 9.6.2基因治疗中的病毒载体用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：携带外源基因并能装配成病毒颗粒；介导外源基因的转移和表达；对机体没有致病力。183 1、病毒载体的产生将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。将基因表达盒插入HSV-1病毒的UL44（编码糖蛋白C）基因的XbaI位点中，构建成重组HSV病毒。由于UL44基因对HSV病毒感染非必需，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。184 2、重组型病毒载体在不改变病毒复制和包装所需的顺式作用元件的情况下，选择性删除病毒的某些必需基因尤其是前早期或早期基因，所缺失的必需基因由同时导入细胞中的外源基因表达单位提供。一般通过同源重组方法将目的基因插入到病毒基因组中。185 3、无病毒基因的病毒载体在辅助系统的作用下，重组载体以特定形式（单链或双链DNA或RNA）被包装到不含有任何病毒基因的病毒颗粒中。优点是载体病毒安全性好，容量大。缺点在于往往需要辅助病毒参与载体DNA的包装，造成终产品中辅助病毒污染。186 4、基因治疗中的问题基因导入系统基因表达的可控性需要更多的治疗基因1）基因导入系统。基因治疗的关键是将治疗基因送入特定靶细胞，并得到高效表达。如果不能有效地将治疗基因导入大多数肿瘤细胞，至少要求它尽可能少地进入正常细胞。187 2）外源基因表达的可控性。最理想的可控性是模拟人体内基因本身的调控形式，需要全基因或包括上下游的调控区及内含子序列，将对导入基因的载体系统产生严峻的挑战，因为今后的载体须有几十kb甚至上百kb的包装能力。188 在目的基因上游区接上gal4的顺式元件，用带有疱疹病毒VP16/gal4DNA结合区的孕酮受体的变异体作为激活蛋白。189 图9-31导入基因的表达诱导框架。190 该变异体（PR-LBD△）只能与孕酮的颉抗剂（RU486）相结合而不与孕酮或其他衍生物结合。体系中没有RU486，治疗基因表达水平极低；加入RU486后与PR-LBD△结合，激活VP16，形成杂合二体并通过gal4与治疗基因上游顺式元件结合，启动治疗基因表达。191