巴洛沙星片微生物限度检查方法验证试验探究

巴洛沙星片微生物限度检查方法验证试验探究【摘要】目的建立巴洛沙星片微生物限度检查法。方法制备1:10、1:100的供试液，采用离心沉淀与薄膜过滤的方法，来测定试验菌的回收率。结果供试品稀释100倍后，采用离心沉淀与薄膜过滤法，回收率即可达70%以上。结论可采用离心沉淀与薄膜过滤法消除巴洛沙星的抑菌活性，建立其微生物限度检查法。�【关键词】巴洛沙星；验证试验；离心沉淀；薄膜过滤��AmethodforvalidationofmicrobiallimittestsofbalofloxacintabletsLENGJia-wei.TheDrugControlINstitueofShandong,Shandong250101,China�【Abstract】ObjectiveTosetupamethodfordermimingmicrobiallimitsinbalofloxacintablets.Methods1:10,1:100sampletestsolutionwereprepared,andthecentrifugation,membranefiltrationmethodwereapplied.Therecoverywasdetected.ResultsWhenthesampledilution100times,7 therecoverywasover70%withthemethodofcentrifugationandmembranefiltration.ConclusionAftermethodofcentrifugationcollectionandmembranefiltration,theamountofbacteriaandcontroledbacteriacanbedeterminedinbalofloxacintablets.�【Keywords】Balofloxacin;Validation;Centrifuqation;Membrancefiltration�巴洛沙星是第三代喹诺酮类抗菌药，具有广谱的抗菌活性［2］。根据《中国药典》2005年版二部规定所有非规定灭菌制剂及其原料、辅料，在建立其微生物限度检查法之前，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该制剂的细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌检查方法［1］。据此作者对巴洛沙星片的微生物限度检查法进行了验证试验的研究，建立了巴洛沙星片的微生物限度检查方法。现报告如下。�1仪器与材料�1.1仪器7 BSC-1500ⅡA2-X生物洁净安全柜；MJ-250I生化培养箱；GHP-9270隔水式恒温培养箱；SartoriusCP225D电子天平；HTY-2000B集菌仪(杭州泰林医疗器械厂生产)；NS01-75D2薄膜过滤器(北京牛牛基因技术有限公司)。�1.2培养基营养琼脂培养基(批号：081215)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号：080520)、营养肉汤(批号：070313)、改良马丁培养基(批号：0810092)、胆盐乳糖增菌液(批号：080117)稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：080921)均购于北京三药科技开发公司。�1.3药物巴洛沙星片(山东罗欣药业090230)规格：0.1g/片。�1.4菌株大肠埃希菌(Eschrichiacoli)［CMCC(B)44102］；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)［CMCC(B)63501］；金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)［CMCC(B)26003］；白色念珠菌(Candidaalbicans)［CMCC(F)98001］；黑曲霉(Aspergillusniger)［CMCC(F)98003］均购于中国生物制品检定所医学菌种保藏中心，以上菌种均为第3代菌种。�2验证方法与结果�2.1菌液制备［1］按《中国药典》2005年版二部附录“微生物限度检查法”项下方法制成50~100CFU/ml的菌悬液。�2.2供试液制备取供试品10g，研磨加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液，再稀释成1:100的供试液。取1:100的供试液以500r/min离心37 min取上清液，经过滤后备用。�2.3菌数计数方法的验证�2.3.1细菌数验证方法的预试验�2.3.1.1试验组取上述制备好的1:100供试液1ml，按薄膜过滤法处理，用冲洗液分别冲洗滤膜5次，100ml/次。在最后一次冲洗液中分别加入试验菌50~100CFU/ml，取出滤膜分别贴于营养琼脂平板上。将平板置30℃~35℃培养48h，计数。�2.3.1.2菌液组测定加入的每一种试验菌数。�2.3.1.3供试品对照组按试验组的方法和条件测定供试品的本底数。�2.3.1.4稀释剂对照组按试验组的方法，加入50~100CFU/ml菌液，测定其菌数。�2.3.2细菌数验证方法的正式试验由预试验结果表明，巴洛沙星对细菌具有较强的抑制作用，鉴于此作者把试验方法调整为取1:100的供试液1ml，冲洗量增至1000ml，重新进行验证试验。�2.3.3霉菌和酵母菌数验证方法�2.3.3.1试验组取1ml的1:10供试液和50~100CFU/ml的菌液注入1个平皿中，立刻倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株菌制备2个平皿。�2.3.3.2菌液组测定加入的每一种试验菌数。� 7 2.3.3.3供试品对照组按试验组的方法测定供试品的本底数。�2.4结果回收率的计算公式：［(试验组菌落计数(稀释剂对照组菌落计数)-供试品对照组菌落计数)］÷菌液组菌落计数×100%，最初采用1:10稀释度进行了摸索性试验，结果三种试验菌均受到抑制，尤其对枯草芽孢杆菌回收率为0；故作者在预试验中直接采用1:100稀释度,从表1结果显示，三种试验菌的回收率也未达到70%以上，说明巴洛沙星的抑菌作用2.5控制菌检查方法的验证�2.5.1大肠埃希菌检查方法的验证�2.5.2试验组取规定量1:10的供试液以500r/min离心3min后取全部上清液，将此液全部转移至500mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，摇匀，按薄膜过滤法处理，用冲洗液分别冲洗滤膜10次，100ml/次。在最后一次冲洗液中加入10~100CFU/ml大肠埃希菌，然后将100ml的胆盐乳糖增菌液培养基泵入滤器内，按相应控制菌检查法检查。�2.5.3阴性菌对照组操作方法同试验组。试验菌改为金黄色葡萄球菌作为阴性菌对照菌。�2.5.4验证结果试验组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌，说明上述方法可以用于巴洛沙星片的大肠埃希菌的检查。� 7 3讨论�巴洛沙星属于喹诺酮类第三代抗生素，其对革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、支原体、衣原体、军团菌及某些分枝杆菌都具有较强抗菌活性，且具有良好的药动学性质［3］。这一点与验证实验结果(表1)是一致的。因此，此类药物建立微生物限度检查法时，消除药物的抑菌活性是关键技术。本实验通过多次摸索，建立了巴洛沙星片的微生物限度检查方法即：细菌数测定：取1:100供试液1ml，按薄膜过滤法，用1000mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分10次冲洗后贴膜。霉菌和酵母菌数测定：由表3可知，采用平皿法试验菌的回收率即可达到70％以上。控制菌检查：采用离心沉淀法和薄膜过滤法联合应用，依法进行检查。总之，本论文建立了抑菌活性较强的巴洛沙星片微生物限度验证实验方法，为其他活性较强的抗菌药物微生物限度验证实验提供了借鉴和思路。�参考文献�［1］中国药典委员会.中国药典.北京:化工工业出版社,2005(二部):附录89.�［2］刘明亮.喹诺酮类抗菌药在不同介质中的理化性质.国外医药抗生素分册,2006，27(1)：22.�［3］糜志远,刘万忠.新氟喹诺酮类抗生素巴洛沙星研究进展.中国新药杂志,2005，14(9)：28.� 7 7