《低温生物学》课程教学大纲

《低温生物学》课程教学大纲课程负责人：郑从义课程中文名称:低温生物学课程英文名称：Cryobiology课程类别：选修课程学分数：2学分课程学时数：36学时授课对象：生科院研究生本课程的前导课程：生物学一、教学目的1)了解低温生物学的研究进展2)掌握低温生物学的基本研究技术与技能二、教学要求1)通过多媒体、Powerpoint教学课件组织教学，使教学内容丰富多彩、教学语言简短规范。2)推行教学相长的教学形式，采取课堂教学与课后讨论相结合，要求学生边学习、边消化、不断总结、举一反三。三、教学内容1.绪论1.1低温生物学的定义低温生物学研究自然或人工低温条件下生命不同层次变化规律的科学。它既是生命科学，又是技术科学。学科发展以细胞生物学、遗传学、微生物学、生物化学、生物物理学、临床医学为基础，物理、化学、低温工程、计算机技术为依托，是一门理工交叉学科。现代低温生物学研究生物个体的低温生存环境，离体生物材料的低温保存，植物的冻害及耐寒性，探索低温损伤机理，发掘低温抗冻物质，实施冷冻医疗，从而阐明低温条件下生命现象的特征及其本质。1.2低温生物学研究范畴低温生物学研究进展较快，研究范畴涉及生命科学和医学的方方面面。对自然状态下的生物耐寒性、低温冷休克的理论研究，生物材料冷冻保存以维持包括高等生物在内的细胞、组织、器官以及个体的生活状态的应用研究，低温医学的理论与应用研究等均是当前研究的热点。如按学科分类，其研究范畴包括：8 低温微生物（10℃以下正常生长的微生物）微生物低温生物学极地微生物（南、北极存在的微生物）菌种保存人和动物的低温冻伤、低温冷休克动物冬眠低温免疫动物及其材料的低温生物学动物细胞保存动物胚胎保存动物精子保存原生动物保存植物的耐寒与抗冻植物材料低温生物学植物种质资源保存与利用植物材料的低温保存低温生理（体温过低症、低温麻醉、低温酶学）低温医学低温保存（治疗性细胞、组织、器官保存）冷冻医疗（冷冻治疗、冷冻器械）冷冻医疗器具的设计、制造冷冻医疗器械的工程学低温保存设备、仪器的设计制造冷冻医疗的理论基础低温生物传热的工程物理学冷冻医疗器械设计理论依据水冻结的理论依据生物材料保存的热物理问题低温保护剂应用的理论基础8 1.3低温生物学研究的进展1.3.1玻璃化冷冻保存新技术的研究与应用玻璃化冷冻保存新技术是一种将生物材料（细胞）与保护剂溶液混合以足够快的降温速率过冷至玻璃化温度，使其固化形成冷冻玻璃态（非晶态）而达到长期冻存的目的。由于在冷冻过程中，避免了细胞内外冰晶的形成，减少了冷冻过程对细胞的损伤，使得小鼠胚胎，植物细胞、愈伤组织、茎尖等难于冻存的生物材料可以有效冻存。因此，玻璃化冻存技术成为20世纪90年代低温生物学研究中一项重要的冷冻保藏新技术被应用。90年代中期，我们找准了国际上研究的这一主流方向，结合自己的实际情况，制定切实可行的研究计划，与杨弘远院士实验室、中南林业大学等实验室合作，开展了植物细胞，植物愈伤组织、植物花粉等生物材料的玻璃化保藏研究，并积极向国家申请课题，最终获得国家教委重点资金项目资助，使研究计划步入正轨。经过不懈的努力，在动物细胞、植物愈伤组织、植物花粉的玻璃化冻存技术方面均取得突破，建立了自主知识产权的技术规范。尤其是玻璃化溶液配方、过冷条件、玻璃化形成效率等技术指标具有中国特色，研究成果得到国内外同行的认可，产生了较明显的经济效益。1.3.2动物细胞冷休克研究的起步与发展20世纪90年代中期，低温生物学基础研究取得重大突破，为研究细胞冷休克产生机制奠定了理论基础，使得细胞冷休克产生机制成为研究热点之一。我的研究工作几乎是同时起步，经过几年的努力，目前研究取得较大进展，初步阐明了动物细胞冷休克产生的动力学特征，比较了人体细胞与昆虫细胞冷休克差异性，证明了昆虫细胞（Sf9）在0－4℃具有冷休克适应性等。尤其是冷休克诱导肿瘤细胞凋亡及其动力学特征的研究形成特色，通过应用扫描电镜观察、末端DNA转移酶介导的脱氧UTP缺口末端标记技术（TUNEL）和流式细胞术研究低温冷休克诱导人乳腺癌细胞系细胞凋亡，并对其细胞凋亡的动力学特征测定、分析。结果显示：－5℃、0℃、4℃冷休克均可诱导细胞凋亡，但细胞凋亡进程受实验细胞预培养时间，冷休克温度、时间，细胞冷休克后恢复培养时间的影响，这些影响因素具有明显的动力学特征。经过冷休克诱导细胞凋亡的动力学特征分析、比较，优选出研究冷休克诱导肿瘤细胞凋亡的实验体系：即细胞经37℃预培养36h→冷休克（－5℃24h、0℃36h、4℃48h）→细胞冷休克后于37℃恢复培养18－24h→8 细胞凋亡检测→检测结果综合分析。应用该实验体系可使细胞凋亡率达50－60％，且重复性尚佳。优化体系为深入研究冷休克诱导细胞凋亡的信号传递及其分子机制提供实验模型。参考这一实验研究模型，我们研究了冷休克对不同来源肿瘤细胞诱导凋亡的发生与发展，获得一组组非常有用的数据，使这一研究在国内处于较高的水平，发表研究论文10余篇。1.4低温生物学研究的热点问题1.4.1抗冻蛋白基因克隆、表达与应用抗冻蛋白（Antifreezeproteins），亦称热滞蛋白，是一类抑制冰晶生长的蛋白质，能以非依数形式降低水溶液的冰点，而对熔点影响甚微，致使水溶液的熔点和冰点间出现差值，从而达到抗冻的目的。抗冻蛋白最早发现于极地鱼类，随后在一些节肢动物、昆虫、植物和细菌中也有发现。现已证明，虽然抗冻蛋白的抗冻活性基本相同，功能也比较接近，但不同物种来源的抗冻蛋白其组成、结构差异显著。可见，抗冻蛋白活性、功能主要表现在蛋白折叠构象和特殊基因上。这是一类极为特殊的蛋白质，其在生物体内或细胞中的合成受环境温度的影响，是动物自我调节的应急蛋白质，在低温生理适应过程中发挥重要作用。鉴于抗冻蛋白在胚胎、细胞、组织、器官等生物材料的保存中具有延滞冰晶形成，保护细胞免受损伤的作用，因此，已有用抗冻蛋白替代化学试剂作为低温保护剂的研究报道，证明了抗冻蛋白的保护作用。问题在于其成本过高，广泛应用存在一定问题。迄今，抗冻蛋白研究的前沿集中在抗冻蛋白基因的克隆与表达，诸如鱼类afp基因、植物afp基因、昆虫afp基因和细菌afp基因都先后被克隆与表达。这些基因的克隆与表达，对研究抗冻蛋白的抗冻活性，结构与功能的关系具有重要意义，近年已取得进展，在今后几年内将会有重大突破。1.4.2器官的长期保存与应用随着免疫抑制剂在临床上的广泛应用，移植免疫排斥问题得到有效的控制，使得多种器官移植的成功率显著提高，对器官的需求率大增，器官的供求矛盾日趋突出。这给低温生物学研究提出了更高的要求，解决器官的长期保存问题迫在眉睫。然而，器官的长期保存还有很多理论问题急需解决，技术手段待建立及完善，这些问题促使国内外低温生物学家去探索，也成为21世纪需要突破的热点问题。8 2.低温生物学基础2.1物理及化学基础2.1.1低温保存与低温损伤2.1.1.1低温保存1)温度4℃－40℃－80℃－196℃红细胞12年动物细胞40年2)冷冻速率细胞密度细胞体积细胞表面积保护剂种类保护剂浓度3)冻存温度－80℃－196℃0—－60℃危险温度4)复温37℃—40℃5)稀释、培养6)检测2.1.1.2低温损伤1)胞内产生冰晶造成的损伤冷却越快，损伤越大，形成胞内冰晶2)溶质损伤慢冷，无胞内冰晶形成，溶质浓度改变，细胞收缩，胞内水分渗出3)造成冷冻损伤的重要因素①保护剂的种类、浓度，加入、移出的方式②过高的保存温度>－60℃不可取，微小冰晶，再结晶损伤③预冻条件A.微生物冻干预冻B.动物细胞材料预冻④解冻条件2.1.2溶液的冻结特性与细胞的损伤8 2.1.2.1水的冻结特性冰晶形成的影响2.1.2.2溶液的冻结特性①溶质浓度②溶质种类③配比④性质2.1.3低温保护剂和冻存液2.1.3.1保护剂①渗透型：二甲亚砜、甘油②非渗透型：葡聚糖、羟基淀粉、聚乙烯吡咯酮2.1.3.2冻存液电解质（盐）③组成高渗液（脱水）营养液④注意事项：pH值、活性分子（蛋白质）2.1.4玻璃化保存液与玻璃化玻璃化：液体转变为非晶体态的固化过程。正常情况下，液体冻结时产生规则的晶体或部分晶体，易造成对活细胞的直接损伤。溶液的玻璃化①原则高浓度易形成玻璃化，对细胞不利温度（低温操作）②比例③温度2.2工程基础2.2.1仪器与设备2.2.1.1液氮容器8 ①常规使用：贮存型、运输型②自动化管理2.2.1.2低温冰箱③－40℃以上④－80℃2.2.1.3程控降温仪⑤种类⑥精度⑦使用范围2.2.1.4冻干机⑧种类⑨精度⑩使用范围⑪冻干程度3．低温生物学的基本技术3.1目的1)保持动物细胞系的遗传稳定性2)防止外源因子的污染3.2动物细胞系保藏的标准程序3.3动物细胞系冻存前期工作1)冻存管的准备2)冻存液的制备①保护剂②培养液③pH值④温度3)胰酶4)培养基5)血清6)生长因子7)抗生素3.4动物细胞系的冻存程序1)细胞的培养与传代①悬浮细胞②贴壁细胞2)细胞的收集与浓度调整①细胞收集②细胞计数8 1)细胞冻存液的配制①保护剂浓度②配制原则2)冻存悬浮细胞的制备3)分装4)冻存①一般冻存方法②标准冻存方法5)质量控制①细胞活性检测②细胞污染检测6)冻存程序小结3.5动物细胞系质量控制1)细菌、真菌污染检测2)支原体污染检测3)病毒污染检测4.参考文献1.GrahamLA.1997,Hyperactiveantifreezeproteinfrombettle.Science,388:727-728.2.HonW-C.1995.Antifreezeproteinsinwinterryearesimilartopathogenecis-relatedproteins.Plantphysiol,109:879-889.3.JiangY,WeiLB,FeiYB.1999.PurificationandidentificationofantifreezeproteinsinAmmopiptanlansmongolicus.ActaBotsin,41(9):967-9714.Crevel,R.W.R.;Fedyk,J.K;Spurgeon,M.J.Antifreezeproteins:characteristics,occurrenceandhumanexposure.FoodandChemicalToxicologyVolume:40,Issue:7,July,2002,pp.899-9035.Marshall,ChristopherB.Daley,MargaretE.Graham,LaurieA.Identificationoftheice-bindingfaceofantifreezeproteinfromTenebriomolitor.FEBSLetters.Volume:529,Issue:2-3,October9,2002,pp.261-2676.HongWang,Li,Wusteman,MonicaC.Smallwood,MaggieThestabilityduringlow-temperaturestorageofanantifreezeproteinisolatedfromtherootsofcold-acclimatedcarrots.CryobiologyVolume:44,Issue:3,June1,2002,pp.307-3108