细胞生物学实验二 脂类细胞化学—山东大学苏丹ⅲ染色法

实验二脂类细胞化学——苏丹Ⅲ染色法13生物基地201300140059刘洋2015-03-16同组者：吕赞孙佳孟何娟一、实验目的1.了解脂肪染色的原理以及脂类标本制片的原理。2.学习用苏丹Ⅲ染色脂肪细胞的方法。3.学习用断头法处死小白鼠以及小白鼠的解剖方法。二、实验原理脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等。脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质，根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪，游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内，比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合，将细胞质及细胞核挤到一旁，如脂肪细胞。脂肪不溶于水，易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂类标本一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定液。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV、苏丹黑或者苏丹红等溶于脂类，苏丹染料是偶氮染料，它对脂类的显示是一种简单的物理变化。使用时，要注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂肪。苏丹染料是一种脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。用锇酸固定的脂肪不溶于无水乙醇、二甲苯等类似的液体，可用于石蜡切片，但是脂肪的标本一般不用石蜡切片或火棉胶包埋，而用如下方法：（1）冰冻切片；（2）明胶包埋冰冻切片；（3）铺片法。三、实验材料和用品1.材料小鼠肠系膜。2.试剂苏丹Ⅲ染液，70%乙醇溶液，甲醛钙。3.器材显微镜，载玻片，盖玻片，胶头滴管，镊子，剪刀，解剖盘。四、实验步骤1.断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊子提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，在肠系膜的另一侧盖一盖玻片，将肠系膜连同小肠一同剪下。2.滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。 1.吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。2.用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤3的操作，再进行一次冲洗。3.用苏丹Ⅲ染色30分钟。4.吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，用显微镜观察。一、实验结果脂肪细胞的几张特写二、讨论与结论1.在显微镜下观察到的脂肪细胞颜色较浅，可能是染色时间稍短，或者染色液的量偏少。2.观察到的脂肪细胞有些不是一层，而是多层细胞重叠在一起，可能是在取肠系膜时，所取的肠系膜过厚或者是取肠系膜时没有展平，或者时间过长，肠系膜收缩。所以在实验时，要注意肠系膜的选取，以取得更好的实验结果。3.在处死小鼠时手不够稳，导致小鼠遭受了很多次刺伤才死去，对此表示十分遗憾。三、附录1.糖类细胞化学（1）PAS染色又称过碘酸雪夫染色，糖原染色。一般用来显示糖元和其它多糖物质。过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，红色，定位于胞浆上。 应用：随着医学实验技术的发展，糖原染色应用的范围更加广泛，如用以证明与鉴别细胞内空泡状的性质，心肌病变及其他心血管疾病的诊断，糖原累积病诊断和研究，糖尿病的诊断和研究，用于某些肿瘤的诊断等。除用于糖原的鉴定和黏液的显示外，还可以观察肾小球基底膜、结肠杯状细胞中性黏液物质、阿米巴滋养体和霉菌的着色。临床诊断、分类和治疗提供了重要的依据。试剂：Carnoy固定液：纯酒精60ml　冰醋酸10ml氯仿30ml,也可以选用75%酒精.1)过碘酸酒精夜配法:过碘酸(HIO.2HO)0.4g　95%酒精35ml　M/5醋酸钠(2.72g+蒸馏水100ml)5ml蒸馏水10ml保存于冰箱内,用棕色瓶,可用两周.2)Schiff氏液:0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中,时时摇动三角瓶5分钟,使之充分溶解.冷却至50℃后过滤加入10毫升1N盐酸.冷却至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸钠,在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存.3)Schiff氏酒精液配置　Schiff氏液11.5ml　1NHCI0.5ml　纯酒精23ml4)亚硫酸水1%偏重亚硫酸钠10ml　1NHCI10ml　蒸馏水180ml的树胶溶解。5）哈瑞或迈耶苏木精略染色步骤:1）石蜡切片脱蜡至水（细胞涂片，冰冻切片直接水洗）2）蒸馏水洗3）过碘酸酒清夜10min4）自来水冲洗10min5）Schiff氏液10min6）流水冲洗5min7）用哈瑞苏木精或迈耶苏木精染核3min(细胞核染色过深可用盐酸酒精分化）8）流水冲洗5min9）常规脱水、透明、封固结果:阳性反应，胞浆呈红色，阴性反应，胞浆呈无色；在正常血片中RBC不染色；PLT染成深红色；中性粒细胞胞浆染成红色或深红色，有些细胞有阳性颗粒；单核细胞的胞浆染成淡红色，可含有细小或粗大阳性颗粒；少数淋巴细胞的胞浆内含有少许小的淡红色或红色颗粒；正常骨髓的幼稚细胞和有核RBC都不染色；巨核细胞的胞浆内呈弥散红色或深红色。巨核细胞的胞浆内呈弥散红色或深红色。（2）阿新蓝-PAS法显示酸性、中性黏多糖阿新蓝属于阳离子染料，是显示酸性黏液物质最特异的染料，染料与酸性基团形成盐键。利用染料的不同pH及不同电解质浓度，可区分酸性黏液物质的类别。1.核酸细胞化学 （1）Feulgen反应法DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时还原，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色，其反应式见图。利用1NHCl、60℃下水解时，可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应，因此利用孚尔根反应，可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。(2)甲基绿-派洛宁法甲基绿,派洛宁为两种碱性染料,与带负电荷的磷酸根形成盐键。甲基绿分子有两个正电荷,是具有金属光泽的绿色微结晶或亮绿色粉末。溶于水，显蓝绿色。稍溶于乙醇，不溶于戊醇。盐酸中显红黄色，在氢氧化钠中无色。试剂溶液在可见光区有吸收峰。甲基绿—为碱性染料,它分别能与细胞内的DNA、RNA结合呈现不同颜色。甲基绿易与双链DNA分子结合,使DNA显示绿色。派洛宁为碱性染料，有一个正电荷,易与单链RNA结合使RNA显示红色。所以派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。也有人认为染色原理与核酸分子的空间构型有关。 (3)Giemsa染色法Giemsa染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，适用于多种细胞和染色体染色。其主要用Giemsa染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。试剂：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余的甘油混在一起，56℃保温2小时后，加入33mL纯甲醇，保存于棕色瓶内。染色步骤:1）准备染液：用pH6.81～7.38的Sorensen缓冲液，按1:9比例取Giemsa染液和Sorensen缓冲液混合配成染色液；Sorensen缓冲液的配制：pH6.81：Na2HPO4(1/15M)50mL+KH2PO4(1/15M)50mL;pH6.98：Na2HPO4(1/15M)60mL+KH2PO4(1/15M)40mLpH7.17：Na2HPO4(1/15M)70mL+KH2PO4(1/15M)30mL；pH7.38：Na2HPO4(1/15M)80mL+KH2PO4(1/15M)20mL。2)细胞标本用甲醇固定10分钟，或用1:3醋酸/甲醇固定30分钟，用滴管把染色液布满玻片上，注意不要有气泡，用染色缸染色亦可，染10～15分钟；3)用自来水冲去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光学树脂胶封固。染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。缓冲液pH值要准确，否则影响染色效果。用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染色。染色完毕将标本浸入水中洗除染液。结果：Giemsa染色光镜下观察细胞核呈紫红色或蓝紫色，细胞浆成粉红色。（4）苏木精-伊红(HE)染色去氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中称蓝色,所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明对比.伊红是细胞浆的良好染料。一般染色组织切片厚度为3µm左右,中枢神经系统6～8µm,肾小球基底膜染色观察时要求1.5～2µm标准厚度。染色步骤：1）切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。 2）移入二甲苯和纯酒精（1∶1）混合液中5分钟左右（如经二次二甲苯脱蜡，此步可略）。3）入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5分钟。最后经蒸馏水转入染液。4）苏木精染液染色5～15分钟。5）水洗玻片上多余染液，0.5～1％盐酸酒精（70％酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。6）流水冲洗15～30分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。7）蒸馏水短洗。8）0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。9）依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。10）二甲苯透明（二次），共约10分钟。11）封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。3.蛋白质细胞化学（1）碱性蛋白与酸性蛋白显示蛋白质的基本组成单位是氨基酸，它们同时具有氨基和羧基(在溶液中主要以—NH3+，—COO—式存在)，而自由氨基和羧基的游离取决于溶液的pH值，当蛋白质处于酸性溶液时，由于该溶液中正离(OH—)多，从而抑制蛋白质中的COOH电离，于是造成蛋白质带正电荷多；当蛋白质处于碱性溶液时，由于该溶液中负离子(OH—)多，从而促使蛋白质中的COOH都电离成COO—，于是造成蛋白质带负电荷多；当蛋白质处于某一种pH溶液时，它恰好带有相等的正负电荷(呈兼性离子)。此时的pH值称为等电点(pL)，由于蛋白质除了末端氨基和末端羧基之外，还具有许多侧链，其上的许多基团在溶液中也都可以电离，因此，一个蛋白质分子表面四周都有电荷。不同蛋白质分子所带有的碱性基团和酸性基团的数量不等，故它们的等电点也不一样。因此蛋白质分子所带的净电荷取决于：(1)分子中碱性基团和酸性基团含量。(2)所处溶液的pH值，如在生理条件下，整个蛋白质带负电荷多。为酸性蛋白质(等电点偏向酸性)；带正电荷多，为碱性蛋白质(等电点偏向碱性)。据此，可将标本经三氯醋酸处理后，用不同pH的固绿染液(一种弱酸性染料，本身带负电荷)，予以染色，可使细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白分别显示。（2）酸性或碱性磷酸酶显示碱性磷酸酶染色（NAP）中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6的碱性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢酱紫等。酸性磷酸酶显示酸性磷酸酶主要位于溶酶体内，是溶酶体的标志酶，而具有吞噬作用的细胞（如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）中溶酶体含量最多，在吞噬过程中溶酶体起着十分重要的作用。Gomori氏法显示酸性磷酸酶的原理：细胞中的酸性磷酸酶分解底物（β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基，在pH5.0的环境中，磷酸基与硝酸铅反应，形成磷酸铅。但因其是无色的，所以再经过与硫化铵的作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀。由此而显示酸性磷酸酶在细胞内的存在和分布。 （3）过氧化物酶显示（色素形成法）细胞内的过氧化物酶可以将联苯胺氧化成蓝色或者棕色产物，蓝色为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙，通过产物颜色间接显示出细胞内过氧化物酶的分布。（4）酶联仪测定琥珀酸脱氢酶（MTT法）噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，而死细胞没有这种功能。结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。