重组人神经肽y受体y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究论文

　　重组人神经肽Y受体Y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究论文丁克祥董萍郑永晨杨永鹏朱晓亮韩晋云单志新丁宇丁振华【摘要】目的在大肠杆菌中表达人神经肽YY1受体，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aY1转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和ethodsTherebinantplasmidpET28aY1edatography.ThenbioinformaticanalysisoftheY1receptoridpET28aY1expressedrebinanthumanY1receptorprotein.Highlypurifiedfusionproteinatography.RelatedbiologicalcharacteristicsofY1receptoridpET28aY1canbesuccessfullyexpressedinDE3.HighlypurifiedproteinscanbeobtainedbyNi2+NTAaffinitychromatography.Y1receptor′sbiologicalcharacteristicsarepredicted,ent.【Keyatics神经肽Y(Neuropeptide,NPY)是一种内源性的促食欲因子，NPY主要通过与相应受体结合起作用。其受体(Receptor)主要有Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6受体亚型,属于G蛋白偶联的受体家族。这些受体亚型介导信息传导均与G蛋白偶联有关,均能抑制腺苷酸环化酶的生物合成,最终动员或抑制钙离子释放。不同受体起不同的作用,各组织所含受体种类及分布密度也不相同〔1～4〕。NPYY1、Y2和Y5受体(NPY1R,NPY2R,NPY5R)被认为与NPY诱导摄食和引起肥胖的作用机制有关。实验表明,在NPY1R缺失小鼠中NPY诱导的摄食效应明显减弱〔5〕;肥胖大鼠口服NPY1R抑制剂能够抵抗肥胖〔6〕;NPY1R抑制剂脑室注射能减少大鼠或小鼠的摄食〔7，8〕。这充分说明,NPY1R在大鼠和小鼠的食物摄取和体重调控中起着重要作用。1材料与方法1.1材料E.coliBL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aY1的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1重组人NPY1R融合蛋白的诱导表达 用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aY1的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5mlLB(Kan+)液体培养基，37℃振摇培养过夜。次日取培养过夜菌液500μl再接种于50ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1ml后加入IPTG，终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养4h。取加IPTG前和后的菌液各1ml，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50μl，混匀，沸水浴5min，12000r/min离心10min，每个样品取20μl上样于10%的SDSPAGE胶上电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2h，然后脱色，拍照记录结果。1.2.2包涵体的释放据上所述，在2000ml的摇瓶中装500ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃，5000r/min，离心15min，收集菌体沉淀;加入25mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃12000r/min离心30min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃12000r/min离心细菌冻融液30min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超声处理，10min/次，处理时间30min;超声处理后，于4℃12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。1.2.3包涵体的提纯于菌细胞裂解沉淀物中加入含4mol/L尿素的包涵体提纯液25ml,.freelin,12000r/min离心30min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。1.2.4包涵体的裂解于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25ml，吹打混匀，室温静置6h，使包涵体充分裂解,2000r/min离心30min，收集上清液，即为包涵体裂解物。1.2.5变性蛋白的复性将收集的包涵体裂解物上清液加入到处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端;将透析袋整体浸没于蛋白复性液，在4℃条件下透析;复性液中的尿素浓度从7～1mol/L依次递减,在每个尿素浓度梯度复性液中透析3～4h。每次更换不同尿素浓度复性液之前，需要将透析袋内的样品吸出，4℃，12000r/min，离心30min，再把上清液加入透析袋内，重新扎紧进行透析;透析完毕后，将样品取出，4℃，12000r/min，离心30min，再将上清液加入透析袋，在4℃预冷的PBS中透析20h;取出透析好的样品，4℃，12000r/min，离心30min，收集上清液即为复性产物。-70℃保存。1.2.6复性产物的纯化①上样：将复性产物缓慢加于已用PBS缓冲液平衡的镍离子亲和层析预装柱中，加样所用的流速要控制在1ml/min以内;② 冲洗：PBS洗涤除去未结合蛋白，冲洗流速应控制在5ml/min以内;③洗脱：分别用含50、100、150mmol/L咪唑PBS缓冲液洗脱融合蛋白，流速5ml/min。1.2.7纯化产物：蛋白Marker;1：IPTG诱导后;2：IPTG诱导前图1重组融合蛋白的诱导表达2.2融合蛋白纯化后的鉴定NPY1R蛋白在含150mmol/L咪唑PBS缓冲液可以完全被洗脱,分别进行10%的SDSPAGE电泳鉴定(图2)。M：蛋白Marker;1～3：分别为50、100、150mmol/L咪唑PBS缓冲液的洗脱液图2重组融合蛋白的亲和层析纯化2.3纯化蛋白的ODEL三级结构预测服务器，预测结果见图8。2.4.7抗原性分析利用在线软件对NPY1R的抗原性进行分析结果见图9，有13个抗原决定簇可供选择，以便进行相关实验。3讨论到目前为止,已发现了NPY的6种受体亚型：Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6，它们都是7次跨膜，1个外侧区的N糖基化位点和胞内侧区的C短氨基酸末端，与G蛋白相偶联的刺激肽受体家族的成员。不同类型的受体在海马区的分布不同，其中NPY2R在此区表达最为丰富，并主要分布于海马区的多形层、锥体层及放射层。普遍认为NPY2R是海马中最为丰富的NPY受休亚型。NPY1R中等量表达于腹侧海马回和齿状回，NPY5R少量分布于腹侧和背侧海马的多形层和锥体层，而在人体脑组织中的下丘脑和齿状回颗粒层表达显著，与下丘脑其他部位比较，NPY5R在ARC中表达最显著。运用NPY1R激动剂能有效刺激动物进食,反义基因或拮抗剂则抑制进食;将NPY注入NPY1R缺陷小鼠的脑室后,其摄食活动明显减少;在饥饿状态下，NPY1R的基因表达增加;将NPY1R拮抗剂BIBO3304和SR120562A分别注入大鼠第三脑室后,由NPY诱导的进食行为明显受到抑制,而由禁食所诱导的进食行为只受到轻微的抑制;在对动物进行夜间禁食后发现，NPY1R拮抗剂BIBO3304,而不是NPY5R拮抗JCF104,能抑制动物进食〔9〕。这些研究表明,NPY的食欲促进作用与NPY1R密切相关。此外，NPY1R还参与了机体其他生理活动。本文在完成重组人源化NPY1R基因克隆及序列分析〔10〕的基础上,将NPY1R基因与pET28α载体连接后表达于DE3中。pET28a表达载体在N端含有HisTag寡聚组氨酸链,因此,表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。我们所设计的NPY1R融合蛋白N端为23个氨基酸组成的非目的蛋白，其中包含一个His tag，其后的目的NPY1R蛋白有384个氨基酸。即pET28aNPY1R表达的融合蛋白共由407个氨基酸组成,分子量约50kD左右。用6×Histag抗体进行M，GeddaK,etal.IntronmediatedexpressionofthehumanneuropeptideYY1receptor〔J〕.MolCellEndocrinol,2002;188：8597.2MullinsD，KirbyD，Hacol，2001;60：53440.3IshiharaA，KanataniA,MashikoS,etal.AneuropeptideYY5antagonistselectivelyamelioratesbodyetersindietinducedobesemice〔J〕.PNAS，2006;103(18):71548.4PittnerRA,MooreCX，BhavsarSP,etal.EffectsofPYY〔3236〕inrodentmodelsofdiabetesandobesity〔J〕.ObesRelatMetabDisord,2004;28：96371.5KanataniA，MashikoS，MuraiN,etal.RoleoftheY1receptorintheregulationofneuropeptideYmediatedfeeding:parisonofice〔J〕.Endocrinology,2000;141:10116.6IshiharaA，KanataniA，OkadaM,etal.BlockadeofbodyacorticosteronelevelsinZuckerfattyratsusinganorallyactiveneuropeptideYY1antagonist〔J〕.BrJPharmacol，2002;136:3416.7LopezValpuestaFJ，NyceJashikoS，MuraiN,etal.RoleoftheY1receptorintheregulationofneuropeptideYmediatedfeeding：parisonofice〔J〕.Endocrinology，2000;141(3):10116.10丁克祥,董萍,郑永晨,等,与肥胖相关的神经肽Y受体Y5基因的克隆及序列分析〔J〕.国际护理学杂志,2009;28(4):5579.