荷叶碱在大鼠体内的绝对生物利用度研究论文

　　荷叶碱在大鼠体内的绝对生物利用度研究论文谢水林，王翌尧，谭玉溪，卢沛枫，田春娟，戴仁科【摘要】目的研究荷叶碱在大鼠体内的药动学特征及其绝对生物利用度。方法SD大鼠分别静脉注射(5mg·kg-1)和口服(20mg·kg-1)荷叶碱，给药后不同时间点取血，分离血浆.freelL-1,Cmax为(1213.17±359.29)ng·mL-1，t1/2为(1.30±0.69)h;口服荷叶碱的药动学参数：AUC(0-∞)为(3111.34±1986.29)ng·h·mL-1，Cmax为(1257.50±942.37)ng·mL-1,.freelax为(0.33±0.18)h;剂量归一法计算得荷叶碱在大鼠体内的绝对生物利用度为69.56%。结论该方法专属性强，灵敏度高，可用于荷叶碱的体内定量分析。【关键词】荷叶碱;药动学;绝对生物利用度;LCMS/MS法Abstract:ObjectiveToinvestigatethepharmacokiiccharacteristicsofnuciferineanditsabsolutebioavailabilityinrats.MethodsI.v.(5mg·kg-1)andp.o.(20mg·kg-1)administrationaconcentrationofnuciferineinratsinedbyLCMS/MS.ResultsThemainpharmacokiicparametersthroughi.v.andp.o.L-1,Cmax(1213.17±359.29)and(1257.50±942.37)ng·mL-1;t1/2(1.30±0.69)and(4.89±2.88)h.tmaxethodisspecificandsensitive,suitableforinvitrodeterminationofnuciferine.Keyacokiics;absolutebioavailability;LCMS/MS荷叶为睡莲科莲属植物莲(NelumbonuciferaGaertn)的叶，味苦，平，归肝、脾、胃经，具有清暑利湿、升发清阳、清心去热、止血利水的功效。荷叶碱(nuciferine)作为荷叶的主要活性成分，具有降脂减肥、抑菌、抗病毒等药理活性1～3。有关荷叶碱的绝对生物利用度的研究尚未见文献报道。本实验采用高效液相串联质谱法分别测定大鼠静脉注射和口服荷叶碱后的血药浓度，并对其体内药动学过程和绝对生物利用度进行了研究，为荷叶生物碱提取物进一步的临床应用提供依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1主要仪器API3000型三重四极串联质谱仪(美国AppliedBiosystem公司);LC20AD高效液相色谱仪(岛津);LNGT83真空离心浓缩系统(国产);AND微量电子天平(日本);3k15高速台式离心机(美国Sigma公司)。1.1.2药品与试剂荷叶碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111566200402);内标非那西丁(中国药品生物制品检定所，批号：100783 200401);甲醇、乙酸乙酯、乙腈均为色谱纯，其它试剂为分析纯。1.1.3实验动物健康SD大鼠12只，雌雄各半，体质量(200+10)g，购自南方医科大学实验动物中心(证号为SCXK粤2006-0015)，实验前12h禁食不禁水。1.2实验方法1.2.1动物实验方案12只SD大鼠，雌雄各半，体质量(210±5)g，称重后随机分成两组：一组静脉给药(5mg/kg)，另一组口服给药(20mg/kg)，给药后0.033、0.17、0.5、1、1.5、2、4、8、12、24h经眼眶静脉取血约0.3mL，置于有肝素的1.5mL的EP管中，分离血浆后置于-20℃保存。1.2.2对照品溶液及内标溶液的制备精密称取荷叶碱对照品，用甲醇溶解配制成100μg/mL的对照品贮备液。临用时采用流动相甲醇水(体积比1∶1)按倍数稀释法配成一系列质量浓度为1、3、10、30、100、300、1000、3000ng/mL的荷叶碱对照品溶液作为标准工作液备用。另取适量的非那西丁作为内标，用乙腈溶解并稀释成100ng/mL的溶液备用。1.2.3血浆样品处理方法取血浆样品100μL，加入100μL的甲醇水(体积比1∶1)溶液，20μL的非那西丁内标液，涡流混合1min，然后加入800μL乙酸乙酯，涡流5min,离心10min(14000r/min)，取上层有机相，置离心浓缩仪中吹干，残渣用甲醇水(体积比1∶1)溶液定容至100μL，取20μL进样。1.2.4色谱条件4,5色谱柱CapcellC18(2.0mm×50mm，5μm);流动相A为水甲醇(体积比95∶5)，流动相B为甲醇水(体积比95∶5)，流动相A和B均含0.5%甲酸，进行梯度洗脱，梯度条件见表1;流速0.2mL/min;运行时间3min;进样量20μL。1.2.5质谱检测条件采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式检测，辅助气化气流量：7000mL/min;雾化气流量(NEB)：7L/min;气帘气流量(CUR)：7L/min;碰撞气流量(CAD)：7L/min;离子源喷雾电压(IS)：4500V;离子源雾化温度(TEM)：400℃;扫描时间：3min;去簇电压(DP)：45V;聚焦电压(FP)：150V;管入口电压(EP)：10V;Q2出口电压(CXP)：12V。在此质谱条件下，荷叶碱主要生成M+H+准分子离子峰，质荷比m/z为296.20，将上述母离子进行产物离子扫描，产生的主要碎片离子的质荷比m/z为265.30，用于分析的离子对为m/z296.20→265.30。表1待测物和内标的色谱梯度表2结果与讨论2.1方法的专属性依“1.2.3” 项下进行操作，分别制备空白血浆样品、空白血浆加荷叶碱标准溶液和内标溶液样品、给药后大鼠血浆样品，检测结果分别见图1-图3。结果表明，荷叶碱和内标的保留时间分别为0.99min和1.21min，空白血浆中内源性物质和相应的代谢产物、降解产物均不干扰荷叶碱和内标的测定。2.2血浆中荷叶碱标准曲线的制备取大鼠空白血浆100μL，加入荷叶碱系列标准工作溶液100μL，配制成质量浓度为1、3、10、30、100、300、1000、3000ng/mL的血浆样品，然后加入20μL的非那西丁内标液，按“1.2.3”项下操作，以荷叶碱峰面积(As)对内标峰面积(Ai)比值(y)为纵坐标，以荷叶碱质量浓度(x)为横坐标作线性回归，得标准曲线的回归方程为：y=0.0197x+0.00597(r2=0.9992)，表明荷叶碱在1～3000ng/mL范围内线性良好，最低定量质量浓度为1ng/mL。2.3绝对回收率分别配制荷叶碱质量浓度为3、100、1000ng/mL的血浆样品(n=3)，加入内标溶液20μL，按“1.2.3”项下操作;另外用流动相配制3、100、1000ng/mL的标准品溶液，加入内标，直接进样，分别测得样品和对照品的峰面积，样品峰面积和对照品峰面积的比值即为荷叶碱的绝对回收率。结果上述3种浓度在大鼠血浆中的绝对回收率分别为(85.8±6.6)%、(89.0±4.8)%和(86.4±3.1)%。2.4准确度和精密度测定分别配制荷叶碱质量浓度为3、100、1000ng/mL的血浆样品(n=3)，加入内标溶液20μL，按“1.2.3”项下操作，连续测定3d，用当日标准曲线计算样品的准确度以及日间和日内精密度。结果上述3种质量浓度的准确度分别为97.5%、103.0%和101%，日内精密度分别为6.6%、5.3%和1.4%，日间精密度分别为11.9%、11.6%和6.5%。2.5荷叶碱在大鼠体内的药动学参数和绝对生物利用度6只大鼠单剂量静脉注射和口服荷叶碱后，大鼠体内荷叶碱平均血药浓度时间曲线见图4，用DAS2.0软件处理血药数据，主要的药动学参数和绝对生物利用度见表2。表2大鼠静脉注射(5mg/kg)和口服(20mg/kg)的荷叶碱后的主要药动学参数【