生物技术在食品检测方面的应用毕业论文.doc

生物技术在食品检测方面的应用生物技术在食品检测方面的应用：摘要：介绍了DNA探针，PCR技术，免疫检测技术在食品微生物及转基因成分检测中的应用。着重介绍PCR技术的工作原理、应用及其发展前景，同时简要介绍了生物芯片及其在食品检测中的应用前景。关键字：DNA探针;PCR技术;免疫检测技术;生物芯片引言生物技术也译成生物工程，主要包括：基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程，现在生物技术已经发展到高通量组学芯片技术。生物技术作为一种先进科技的检测技术，它被越来越多的应用在食品质量安全检测中。自从20世纪70年代，各种分子生物学技术的不断出现，主要包括核酸分子杂交技术，PCR技术和现代免疫技术等，这些技术目前在食品检测和分析等方面已经得到了较好的应用，另外，生物芯片技术也在食品检测方面显示了较好的应用前景。一、DNA探针（一）、基本原理DNA探针检测微生物的依据是核酸分子杂交，即2条碱基互补的DNA链在适当的条件下，按碱基配对原则形成杂交的DNA分子，若在已知的DNA或RNA片段上加上可识别的标记(例如P35同位素标记)即可制成DNA探针，用以检测未知样品中是否具有与其互补的序列[1]。（二）、应用近年来在微生物检测方面DNA探针杂交技术是十分活跃的，目前已经用DNA探针检测食品中的大肠杆菌（Escherichia.coli）、沙门氏菌（Salmonella）,志贺氏菌(Shigellaspp),李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes),金黄色葡萄球菌（Staphylococcu)等。1991年周志江[2]等人用生物素标记编码大肠杆菌耐热毒素(ST)的DNA片段作为基因探针，检测出了污染食品中含有ST大肠杆菌。二PCR技术（一）、基本原理PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR第7页 生物技术在食品检测方面的应用技术通常由高温变性，低温退火和室温延伸三步反应组成一个循环周期，通过多次反应循环，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是；将待扩增的DNA片段置于高温下使之解链，人工合成的俩条寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段俩侧的俩条链互补结合，DNA聚合酶将脱氧核糖核酸从引物的3’端开始掺入，沿模板按5’—3’延伸后组合成DNA的新互补链。这就快速的使(pg)水平的起始DNA混合物扩增到纳克（ng）级的特异性DNA片段，从而将样品中微量成分检测出来。（二）、PCR技术的应用1、食品中致病微生物的检测单核细胞增生性李斯特氏菌：单核细胞增生性李斯特氏菌（LM）对牛奶食品均有不同程度的污染，是食品中主要的病原菌。孙焕东[3]等人采用裂解法提取DNA，应用半套式PCR技术对其进行检测，设计合成的引物可特异的将其扩增，并对其它菌不产生反应，显示了较强的特异性。从敏感性看，检测限度可达到10个UFC以下，检测只需要5-6h。肉毒梭菌：食品中肉毒梭菌是引起肉类中毒的潜在因素。王颖群[4]等通过检索肉毒神经毒素的基因序列，选择保守区设计简并引物，用以同时扩增A、B、E和F型肉毒梭菌的基因。由于肉毒梭菌中的毒标本，因而用A、B、E和F型肉毒梭菌人工感染10种食品以制备模拟标本，采用适当的方法处理后进行PCR检测，实现了快速、敏感的检测结果。但由于肉毒梭菌中毒最终由肉毒神经毒素引起的，而PCR只能检测肉毒梭菌的存在与否，因而对食品肉毒梭菌和毒素并存，或有菌无菌的情况下，PCR检测不具确定的诊断结果，只具参考价值。沙门氏菌：沙门氏菌是温、冷些动物的肠道菌，分布范围广泛，是食物中常见原因之一。P.Whyte[5]等人采用PCR技术对生禽肉中沙门氏菌进行检测发现，检测出了19%的污染样品。经过鉴定几乎所有的沙门氏菌都具有侵入性相关遗传因子，运用PCR技术不需要特别的技术，就可以检测出沙门氏菌遗传因子，从而检测出沙门氏菌。弧菌：副溶血弧菌是海洋和盐湖中微生物中区系的重要成员。水产品自身携带该菌，此菌给水产品加工带来了难度。有人[6]对相关水产品采用了PCR技术进行检测，发现大多数水产品中都含有副溶血弧菌，采用PCR技术操作简单，周期短，灵敏度高，检测成本低等方面，具有更大的优越性。2、食品中腐败菌的检测第7页 生物技术在食品检测方面的应用腐败菌是食品加工中的一大危害，特别是发酵工业中腐败菌将造成整批产品变质，如能在早期发现腐败菌，人们将能及时采取控制措施，从而保证产品质量，减少损失。利用葡萄糖甘酸酶活性鉴别大肠杆菌是美国和日本等采用的标准方法，但已经发现几种大肠杆菌菌株因基本突变而产生假阴性结果，而样品中另一些微生物则因含有该酶活性，又会出现假阳性结果，因此人们开始利用PCR技术来解决此类问题。糖化酵母是一种主要的啤酒腐败菌，由于其与酿酒酵母有相似的生理特征，因此人们很难将它们区别开来，Yamauchi等根据两者糖化酶基因的不同，设计了检测糖化酵母的正向引物SD-5A和反向引物SD-5B,所需检测时间仅为5h,即使100ml啤酒中只有一个糖化酵母细胞也能被检出。嗜啤酒梳状菌和福瑞森加梳状菌易造成啤酒的严重腐败，Motoyama等根据两株菌16SrRNA和23SrRNA基因间的间隔区的特异性序列分别设计了引物，经PCR后检测，不仅可以将这两株菌同其它菌区分开来，而且还可以将这两株菌区分开。3、食品中病原菌的检测根据病原菌特定的遗传因子，通过PCR可将食品中的病原菌检出，从而避免食物中毒发生。肠出血性大肠杆菌O—157是引起出血性大肠炎，溶血性尿毒症的一类大肠杆菌，由于携带有Vero毒素遗传因子，通过PCR,即便反应中有10个菌存在也可将其迅速检出。几乎所有的沙门氏菌都具有侵入性相关遗传因子IRRA,以此遗传因子设计引物，就可以高灵敏度的检出沙门氏菌。4、食品成分的检测要检测出肉制品中肉的组成比较困难，Beheke等对热处理后的熟肉样品，经PCR后检测，发现牛肉，猪肉，鸡肉和火鸡肉的最小检测量为1%-2%,且肉质制品中的抗坏血酸添加剂不影响检测结果，并指出，在目前，PCR是区分鸡肉和火鸡肉的唯一方法。目前，转基因食品的检测方法主要有三种：核酸检测法，蛋白质检测法，酶活性检测法。每个方法都有各自的特点和不足，而PCR是最常用以及是最适用的检测转基因食品的方法。这是由于PCR法不同于蛋白质和酶活性法，后两者一般不能用于加工后产品的检测，因为蛋白质已经变性，而PCR法不受此限制，已有文献报道[7]在借鉴几种传统定量PCR方法的基础上，建立了一种新的实时荧光定量PCR法对转基因产品进行检测。所谓实时荧光定量PCR技术，是在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。最后，通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。FaridE.Ahmed[8]则采用了另一种PCR技术—Q-PCR(qualitativePCR)第7页 生物技术在食品检测方面的应用对食品中的转基因成分检测后认为该法特异性强，敏感度高，并且灵活性强，对任何食品中的转基因成分都能进行较低含量水平的检测。5、PCR检测方法的问题及展望采用PCR技术对食品中致病微生物及转基因成分进行检测的方法虽然特异性强，灵敏度高，简便快速等优点，但也存在不少的问题。首先就是假阳性结果的产生。PCR是一种极为灵敏的反应，一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果，而样品间的交叉污染或时间延长也会导致PCR产物的假阳性产生。因而在PCR检测过程中必须严格操作，并设立阴性对照，保证检测结果的准确性。第二是引物的问题。目前，PCR引物的合成是该技术普及的最大障碍，有待进一步改善才有希望成为食品微生物常规检测技术之一。此外，各种实验条件控制不当或靶序列的选择不当等，都可能导致产物突变或降低其灵敏度和特异性。因而，稳定性也是PCR技术必须改进的问题之一。三、免疫学方法免疫学方法仪器装置相对造价低廉，操作简便，具有很强的实用性，在食品卫生监测方面已经得到普及。常见的污染食品病原细菌。例如沙门氏菌，李斯特氏菌，大肠杆菌等都可以通过免疫学方法进行分析和检测。近年来，免疫学技术在传统方法上又开发出很多的方法，包括酶免疫测定，放射免疫测定，免疫传感器，荧光免疫测定，免疫磁性分离等[9]。例如有报道[10]将PCR技术与酶联免疫技术相结合，即PCR-Elisa技术，用于大肠杆菌的检测，取得了不错的效果。同样有报道[11]说对食品中的单核细胞增多性李斯特氏菌进行免疫磁性分离，并与PCR方法相结合，建立了检测食品中的单核细胞增多性李斯特氏菌的MIPA方法。检测表明，该方法能够有效的克服食品基质、培养基成分和杂菌对PCR检测的干扰作用，且灵敏度高，检测时间短，结果准确，克服了两者的不足之处。此外，免疫方法也被广泛地应用于赤潮毒素检测，利用抗原抗体反应确定毒素类型及含量。另外，吴定等[12]还建立了乳制品中IgG含量酶联免疫吸附测定，取得了成功。四、生物芯片技术生物芯片的概念是20世纪80年代中期提出的，它是融生物化学及其他物理，化学，计算机科学等学科为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值和广阔的产业化前景。简单地说，生物芯片是便携式生物化学分析器的核心技术第7页 生物技术在食品检测方面的应用[13],其工作原理是将待测样品加在芯片的表面，由于生物分子特异性亲核反应（如核酸杂交，抗原抗体反应等），检测样品中的待测成分分别和芯片上固定化的生物识别分子结合反应，从而实现对样品的分析与检测。生物芯片可以在很小的面积上并行分析成千上万种生物分子，分析结果的可比性好，试剂的消耗量少，并可实现微型化和自动化。就生物芯片而言，目前虽然还没有生物芯片用于食品检测方面的报道，但基于生物芯片是在用于基因表达分析及蛋白质检测方面具有无可比拟的优越性，因而相信生物芯片将在食品安全检测方面表现出良好的前景。五、结论食品安全是现代社会人们高度重视的问题，人们用基因探针，PCR技术，免疫学检测技术等作为现代生物学技术手段应用于食品微生物或食品中转基因成分的检测，具有灵敏度高，操作简便，检测周期短，检测成本低等优点。DNA探针杂交与PCR联合使用检测食品微生物将是今后食品微生物检测技术的一个重要研究方向，若能克服两者存在的易污染产生假阳性结果的缺失，相信大规模推广应指日可待。而生物芯片技术虽然在目前看来还未真正用于食品安全检测，但由于它结合了多门学科的高新技术，其优越性将会日趋明显，预计也将成为未来食品安全检测中的主力军。参考文献[1]卿柳庭,屈小玲.动物医学进展,2000,21(1):22～24.[2]周志江,刘纯杰.兽医大学学报,1991,11(4):314～317.[3]孙焕东,李君文,孙保国,等.中国食品卫生杂志,2000,12(5):20～21.[4]王颖群,严共华,雷祚荣.中国公共卫生,1997,13(9):560～561.[5]PWhyte,KMcGill,etal.veterinaryMicrobiology,2002,2442:1-8.[6]蔻运同,林修光,等.检验检疫科学,2001,11(2):32～35.[7]马荣群,陈红运,黄文胜,等.植物检疫,2002,16(1):61～64.[8]FaridE,Ahmed.TRENDSinBiotechnology,2002,20(5):215～223.[9]王新为,李君文.中国公共卫生,2000,16(8):74～75.[10]BeileiGe,ShaohuaZhao,etal.Microbesandinfection,2002,4:285～290.[11]商海涛,柳增善,等.中国兽医学报,1999,19(4):339～343.第7页 生物技术在食品检测方面的应用[12]吴定,路桂红,等.中国乳品工业,2000,28(2):29～31.[13]杨蓉,谢文章,张亮,等.生物工程进展,1999,19(4):33～38.Abstract:TheapplicationinfoodmicroorganismsandGMOidentificationoffourmodernmolecularbiologytechniqueswereintroduced:DNAprobes,PCRtechnique,immunologicalexamination,biochip.Theprinciple,applicationanddevelopmentprospectofPCRtechniquewereespeciallydetaileddiscussed.Thebiochipanditsapplicationprospectwerealsopresented.Keywords:DNAprobes;PCRtechnique;Immunologicalexamination;BiochipAcknowledgementsMydeepestgratitudegoesfirstandforemosttoProfessoraaa,mysupervisor,forherconstantencouragementandguidance.Shehaswalkedmethroughallthestagesofthewritingofthisthesis.Withoutherconsistentandilluminatinginstruction,thisthesiscouldnothavereacheditspresentform.Second,IwouldliketoexpressmyheartfeltgratitudetoProfessoraaa,wholedmeintotheworldoftranslation.IamalsogreatlyindebtedtotheprofessorsandteachersattheDepartmentofEnglish:Professordddd,Professorssss,whohaveinstructedandhelpedmealotinthepasttwoyears.Lastmythankswouldgotomybelovedfamilyfortheirlovingconsiderationsandgreatconfidenceinmeallthroughtheseyears.Ialsoowemysinceregratitudetomyfriendsandmyfellowclassmateswhogavemetheirhelpandtimeinlisteningtomeandhelpingmeworkoutmyproblemsduringthedifficultcourseofthethesis.MydeepestgratitudegoesfirstandforemosttoProfessoraaa,mysupervisor,forherconstantencouragementandguidance.Shehaswalkedmethroughallthestagesofthewritingofthisthesis.Withoutherconsistentandilluminatinginstruction,thisthesiscouldnothavereacheditspresentform.Second,IwouldliketoexpressmyheartfeltgratitudetoProfessoraaa,wholedmeintotheworldoftranslation.Iamalso第7页 生物技术在食品检测方面的应用greatlyindebtedtotheprofessorsandteachersattheDepartmentofEnglish:Professordddd,Professorssss,whohaveinstructedandhelpedmealotinthepasttwoyears.Lastmythankswouldgotomybelovedfamilyfortheirlovingconsiderationsandgreatconfidenceinmeallthroughtheseyears.Ialsoowemysinceregratitudetomyfriendsandmyfellowclassmateswhogavemetheirhelpandtimeinlisteningtomeandhelpingmeworkoutmyproblemsduringthedifficultcourseofthethesis.第7页